引言：MET 14号外显子（METex14）编码的氨基酸片段是E3泛素连接酶c-Cbl的结合位点，参与MET受体泛素化和降解。METex14跳跃突变可导致MET受体膜旁结构域的缺失，并可能由此导致MET通路紊乱和肿瘤发生。然而，HGF是否是METex14激活和致癌所必需，METex14跳跃突变是否可作为致癌驱动因素及其致癌机制仍不清楚。因此，有研究者探索了HGF在METex14激活和致癌过程中的作用，相关结果已发表于Mol Oncol杂志（IF=5.0），本文对此进行简要解读和分享，希望能为医务工作者提供新的科研和临床参考，造福更多肺癌患者。
背景
MET是一种主要表达于上皮细胞的酪氨酸激酶受体（RTK），由其配体肝细胞生长因子（HGF）激活。编码激酶结构域的MET片段突变或扩增可导致MET组成性激活，从而导致HGF非依赖性细胞增殖和肿瘤生长。
近年来，有研究在包括非小细胞肺癌（NSCLC）在内的多种恶性肿瘤中发现，一系列基因变异，包括点突变、缺失、插入和复杂突变可导致METex14剪接供体或受体位点结构异常和METex14跳跃突变，以及由47个氨基酸构成的膜旁结构域的缺失。METex14编码氨基酸片段是E3泛素连接酶c-Cbl的结合位点，参与MET受体泛素化和降解。可能基于此机制，既往研究证实，MET受体膜旁结构域的缺失可能导致MET通路紊乱和肿瘤发生。
已有研究反复证实METex14跳跃突变患者对MET酪氨酸激酶抑制剂（MET TKIs）敏感，但MET TKIs治疗后客观反应率（ORR）和无进展生存期（PFS）似乎劣于靶向NSCLC其他受体的TKI。因此，更好地了解METex14跳跃突变致癌和对TKI敏感性的机制至关重要。然而，HGF是否是METex14激活和致癌所必需，METex14跳跃突变是否可作为致癌驱动因素及其致癌机制仍不清楚。
为探索HGF在METex14激活和致癌过程中的作用，研究者利用CRISPR/Cas9构建了一种携带METex14跳跃突变的同源化人肺癌细胞模型。基于该模型研究了METex14跳跃突变在体外诱导细胞恶性转化的能力和机制。
结果
METex14的激活依赖于HGF，共同导致持续的下游信号传导
利用CRISPR/Cas9，研究者基于16HBE细胞（永生化的非肿瘤性人支气管上皮细胞系）构建了携带METex14跳跃突变的细胞系（16HBE-ex14），且该细胞系不携带MET扩增或过表达。作为对照，研究者同时对MET野生型细胞系H226和携带内源性METex14跳跃突变的细胞系H596进行了探索。16HBE-ex14和H596细胞系的METex14蛋白水平与MET野生型细胞系没有显著差异（图1A-D）。既往研究已证实，在被HGF激活后，MET受体可迅速内化到细胞中并逐渐降解。当细胞系与HGF孵育120或180分钟时，与HGF孵育前相比，MET野生型细胞系MET受体成熟β链的蛋白水平显著降低（图1A、B、E、G）。在H596细胞中，与HGF刺激前相比，HGF刺激120分钟后METex14蛋白水平没有显著差异（图1B、G）。与既往研究报道一致，METex14缺失会阻碍MET受体与CBL的结合及后续的MET蛋白泛素化和降解。然而，在16HBE细胞中，无论是否携带METex14跳跃突变，METex14在HGF激活120和180分钟后显著降解（图1A、E）。
研究者还探索了所有细胞系在配体刺激后下游通路改变情况。与野生型细胞系类似，METex14跳跃突变细胞系对HGF浓度的增加有反应，且野生型细胞和METex14跳跃突变细胞都依赖于HGF激活MET通路，HGF刺激后15分钟MET受体磷酸化水平显著升高。此外，在两种配对的细胞模型中，野生型细胞MET磷酸化随孵育时间的延长而显著降低，但METex14跳跃突变细胞系中MET磷酸化持续了3小时（图1A、B、F、H）。METex14跳跃突变细胞系中AKT或ERK1/2通路在HGF刺激下的也被持续激活（图1I-L）。上述结果表明，与野生型细胞系相比，在HGF刺激下，METex14跳跃突变细胞系MET受体磷酸化和下游信号活化持续时间更长，且持续活化与MET受体的稳定性无关。
在HGF刺激下，METex14促进细胞运动和锚定非依赖性存活
为了评估METex14跳跃突变是否可导致一系列细胞功能改变，研究者测定了MET野生型16HBE和16HBE-ex14细胞系随时间变化的细胞数改变和细胞运动状态，并在有或无HGF刺激的情况下进行了3D存活和3D侵袭试验。在2D贴壁培养中进行的72小时活细胞测定表明，随着时间的推移，16HBE-ex14细胞数量略高于16HBE-WT，但HGF刺激对任何一种细胞数目都没有显著影响（图2A）。使用Transwell实验评估细胞迁移能力，结果发现只有16HBE-ex14细胞在HGF刺激下迁移能力显著增强（图2B）。对比集落形成能力，细胞在有或无HGF刺激的情况下贴壁低密度生长。在HGF刺激6天后，16HBE-ex14细胞集落比野生型细胞更为松散（图2C、D）。在MET TKI治疗后，16HBE-ex14集落内细胞之间的距离减小到16HBE-WT水平。研究者进一步测定了3D锚定非依赖性和低血清条件下的细胞存活率。与野生型细胞相比，HGF显著提高了16HBE-ex14细胞的存活率，而添加MET TKI可有效抑制HGF诱导的细胞存活率升高（图2E）。综上，METex14跳跃突变本身就足以使细胞发生恶性转化，而无需其他遗传变异或MET过表达的参与。然而，HGF对于METex14诱导的恶性转化是必需的，这表明METex14跳跃突变是HGF依赖性的致癌驱动突变。
HGF对METex14跳跃突变细胞系的转录组学影响
为了进一步表征METex14跳跃突变对细胞恶性转化的影响机制，研究者比较了16HBE-WT和16HBE-ex14细胞在有或无HGF刺激24小时后的转录组学改变。转录组学结果发现，在野生型细胞中，HGF刺激对细胞转录组几乎无影响（图3A）。然而，相较于野生型细胞，16HBE-ex14细胞在HGF刺激后，过表达基因主要富集于细胞外基质重构相关通路（图3A-E）。
在METex14跳跃突变NSCLC患者样本中检测HGF表达
收集一组METex14跳跃突变NSCLC患者组织标本，对18例患者剩余的FFPE肿瘤样本进行了分子检测，仅在1例患者中同时检出MET扩增。在8例患者中检出其他基因伴随突变，包括2例TP53突变、2例PIK3CA突变、1例KRAS激活突变、1例GNAS突变、2例PTEN缺失、1例MDM2扩增和1例CDK4扩增患者。由于先前研究结果支持METex14跳跃突变需在HGF刺激的条件下影响细胞功能，因此研究者在剩余标本可用的患者检测了HGF表达情况（图4A）。在12例HGF IHC结果可判读的样本中，8例样本在肿瘤细胞的细胞质中检出HGF表达（图4B）。有趣的是，所有检出HGF表达的肿瘤METex14跳跃突变均高表达（IHC 2+和IHC 3+），且不伴MET或HGF基因扩增。该结果表明，在本次分析中，约三分之二METex14跳跃突变NSCLC患者肿瘤细胞同时表达内源性HGF蛋白。
图4、在METex14跳跃突变NSCLC患者样本中检测HGF表达
HGF激活METex14可促进肿瘤生长，并使肿瘤对MET TKI敏感
为了研究体内METex14跳跃突变与MET野生型肿瘤生长的差异，研究者在人源化HGF敲除的NSG小鼠中进行了肿瘤异种移植物移植，以激活人源CRISPR 16HBE细胞系中的HGF表达和MET通路。在肿瘤细胞接种10周后，7只接种16HBE-WT细胞的KI-huHGF小鼠中只有1只（14%）形成肿瘤，体积为47mm3。相比之下，所有7只接种16HBE-ex14细胞的小鼠都形成了肿瘤，平均体积为171 mm3（图5A），提示METex14跳跃突变可驱动KI-huHGF小鼠中MET的致癌性。为了评估HGF对MET驱动肿瘤发生的影响，研究者对NSG对照组和KI-huHGF小鼠皮下接种16HBE-ex14细胞。接种8周后，对照组小鼠中9/26（35%）有肿瘤形成，而KI-huHGF小鼠中38/44（86%）有肿瘤形成，且KI-huHGF小鼠肿瘤平均体积显著高于NSG对照小鼠（P<0.001）（图5B）。研究者继续养殖接种16HBE-ex14细胞的KI-huHGF小鼠，待肿瘤体积达到100mm3时，给小鼠饲喂MET抑制剂。如图5C、D所示，与对照组相比，两种MET抑制剂均可显著抑制了肿瘤生长。上述结果表明，在没有其他遗传学改变或MET过表达的情况下，METex14跳跃突变在体内模型中具有致癌性，且在内源性HGF存在的情况下其致癌性更强。
结论
本研究结果表明，METex14以HGF依赖的方式驱动细胞存活、运动、侵袭和恶性转化，以及体内NSCLC肿瘤发生。
本文主要参考Fernandes M, Hoggard B, Jamme P, et al. MET exon 14 skipping mutation is a hepatocyte growth factor (HGF)-dependent oncogenic driver in vitro and in humanised HGF knock-in mice. Mol Oncol. 2023;17(11):2257-2274. doi:10.1002/1878-0261.13397。
CN-145086
声明：本材料由阿斯利康提供，仅供医疗卫生专业人士参考
排版编辑：肿瘤资讯-Shiro
