2024年7月22日，国际知名期刊Cancer Science（IF：4.5）发表了一篇原创研究文章，该研究本研究基于Cell-free DNA（cfDNA）甲基化谱构建了一个胃癌检测模型，并在独立验证集中验证了其有效性。该模型在早期胃癌诊断中表现出高灵敏度和特异性，表明cfDNA甲基化改变可作为早期胃癌检测的潜在生物标志物[1]。【肿瘤资讯】整理该研究要点，以飨读者。
研究背景
胃癌是全球高发且致死率高的恶性肿瘤，早期诊断对改善预后至关重要[2,3]。然而，现有的内窥镜检查和血清标志物检测方法存在不足，亟需开发非侵入性、准确性高且易于检测的生物标志物[4]。
cfDNA甲基化改变作为一种潜在的生物标志物，在多种肿瘤中已得到证实[5,6]。本研究利用cfMeDIP-seq技术对胃癌患者和健康对照的cfDNA进行全基因组甲基化分析，旨在鉴定胃癌特异性甲基化生物标志物，并评估其在早期胃癌检测中的潜力。
研究方法
本研究于2019年1月至2022年12月期间，招募了150例胃癌患者和100例健康对照者，采集其外周血并收集临床资料。研究采用cfMeDIP-seq技术对cfDNA进行全基因组甲基化测序，经质量控制、峰值识别、数据归一化等流程处理测序数据。为减少混杂因素影响，采用倾向得分匹配法，并利用limma包进行差异甲基化区域（DMRs）分析。随后，使用ChIPseeker和annotatr对DMRs进行注释，并通过LASSO回归进行特征选择，构建基于随机森林算法的胃癌预测模型。最后，使用独立验证集和TCGA公共数据集对模型的性能进行验证。
研究结果
患者特征与cfDNA浓度分布
本研究共收集了100例健康对照和150例胃癌患者的血浆样本，其中200例用于发现集，50例用于验证集。排除部分样本后，研究发现胃癌患者的cfDNA浓度显著高于非肿瘤组，但不同分期之间无显著差异，原位癌的cfDNA浓度高于其他分期。此外，cfDNA浓度与肿瘤位置有关，贲门癌高于胃窦癌和贲门癌体部，但与肿瘤亚型、患者年龄和性别无关（图1）。
图1. 胃癌组和非胃癌组患者的cfDNA浓度分布
胃癌甲基化标志物的鉴定
通过分析肿瘤组与非肿瘤组间的DMRs，鉴定出58个胃癌特异性DMRs，其中34个呈高甲基化，24个呈低甲基化（图2）。这些DMRs相关基因主要为假基因、非编码RNA和蛋白质编码基因，其中高甲基化DMRs更多与蛋白质编码基因相关。进一步分析发现，高甲基化DMRs主要位于远端基因间区域，而低甲基化DMRs则分布在远端基因间、内含子和启动子区域。此外，高甲基化与低甲基化DMRs在基因组重复区域上也存在显著差异。功能富集分析表明，高甲基化DMRs相关基因主要参与GTPase活性调控、趋化因子活性等，并富集在趋化因子信号通路和胞浆DNA传感通路；低甲基化DMRs相关基因则主要与胞质分裂和趋化因子受体相关。进一步分析发现，1663个独特的DMRs中，76.4%呈低甲基化，提示肿瘤基因组普遍存在低甲基化现象。这些结果表明，假基因和非编码RNA在癌症中可能具有重要作用，而DMRs则可能通过调控趋化因子和胞质分裂信号通路来影响肿瘤进展。
图2. 胃癌甲基化标志物的鉴定
胃癌早期筛查模型的建立
本研究利用LASSO回归从58个DMRs中筛选出21个关键甲基化标记，并基于这些标记构建了随机森林模型用于胃癌早期检测（图3）。该模型在测试集中表现出优异的性能，AUC达到0.9877，敏感性和特异性分别为93.90%和95.15%。进一步的分析表明，模型的预测能力不受癌症分期、年龄、性别和cfDNA浓度的影响，证实了其稳健性和临床独立性。此外，模型在胃癌各个阶段均表现出一致的预测能力，表明其在胃癌早期检测中具有广泛的适用性。
图3. 早期胃癌检测模型的开发
使用独立数据集验证模型
为了评估模型的有效性，该研究在独立验证集中测试了模型（图4），结果显示模型的AUC为0.9802，敏感性和特异性分别为88.38％和94.23％。进一步分析不同癌症分期的表现，发现模型在各期胃癌中均表现良好。此外，临床亚组分析表明，模型的预测能力与临床特征无关。进一步比较基于年龄、性别、cfDNA浓度以及结合21个DMRs与cfDNA浓度的模型的AUC后发现，结合21个DMRs与cfDNA浓度的模型表现最佳（AUC=0.9875），提示将cfDNA浓度纳入模型可进一步提高早期胃癌检测的准确性。
图4. 在独立验证集中对早期胃癌检测模型的评估
使用公共数据集验证 DMR 相关基因
接下来利用TCGA公共数据集对21个胃癌特异性甲基化标记相关基因进行了验证。结果显示，这些基因的甲基化和表达水平在区分肿瘤和正常样本方面具有良好表现（图5）。其中，ANKRD30BL基因的甲基化水平在13种肿瘤类型中差异显著，在8种肿瘤类型中AUC > 0.8。此外，ZNF74和PKP4基因的表达水平在区分肿瘤与正常组织方面表现出较高的AUC值（> 0.8），而RRN3P1、NPIPB3、CCDC144B、ZNF74和PKP4在10种以上的肿瘤类型中AUC值均 > 0.8。这些结果表明，这21个DMR相关基因的甲基化和表达水平可有效区分肿瘤和正常样本，具有潜在的肿瘤诊断和预后价值。
图5. 公共数据集中DMR相关基因区分肿瘤与对照的能力
讨论
本研究通过全基因组甲基化谱分析，成功鉴定出21个胃癌特异性cfDNA甲基化生物标志物，并构建了高准确率的早期胃癌检测模型。相较于传统的亚硫酸氢盐测序方法，本研究采用的cfMeDIP-seq技术具有更高的基因组覆盖率和对低浓度cfDNA的适用性，尤其适用于早期肿瘤的检测。此外，本研究发现这些甲基化标志物主要与重复区域、假基因、非编码RNA等非蛋白编码特征相关，进一步证实了这些特征在肿瘤诊断中的潜在价值。然而，本研究尚存在一些局限性，如缺乏非肿瘤性胃病患者样本，且筛选出的DMRs的生物学意义尚不明确，有待进一步研究。
结论
本研究通过cfMeDIP-seq方法，验证了血浆cfDNA甲基化作为早期胃癌检测工具的有效性。研究结果揭示了cfDNA甲基化标记在早期胃癌诊断中的巨大潜力，为该领域未来的研究提供了宝贵的数据和见解，有望推动胃癌早期诊断技术的进步。
审批编号：CN-144251
有效期至：2025-9-24
声明：材料由阿斯利康支持，仅供医疗卫生专业人士参考
1. Qi J, et. al. Plasma cell-free DNA methylome-based liquid biopsy for accurate gastric cancer detection. Cancer Sci. 2024 Jul 22.
2. Sung H, et. al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021 May;71(3):209-249.
3. Thrift AP, et. al. Global burden of gastric cancer: epidemiological trends, risk factors, screening and prevention. Nat Rev Clin Oncol. 2023 May;20(5):338-349.
4. Shimada H, et. al. Clinical significance of serum tumor markers for gastric cancer: a systematic review of literature by the Task Force of the Japanese Gastric Cancer Association. Gastric Cancer. 2014 Jan;17(1):26-33.
5. Liu MC, et. al. Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA. Ann Oncol. 2020 Jun;31(6):745-759.
6. Shen SY, et. al. Sensitive tumour detection and classification using plasma cell-free DNA methylomes. Nature. 2018 Nov;563(7732):579-583.
排版编辑：肿瘤资讯-Rex
