Nat Commun：O-糖基化修饰揭示“黑死病元凶”鼠疫菌的生存机制

学术 2024-09-12 16:17 浙江

景杰生物 | 报道

鼠疫耶尔森菌是鼠疫的病原体，这种疾病在历史上造成数百万人死亡，其是一种跳蚤传播的病原体，它的致病机制和生存策略一直是微生物学和感染病学研究的重点。从跳蚤媒介到哺乳动物宿主的转变需要鼠疫耶尔森菌快速调节生理过程以适应恶劣的宿主环境。

蛋白质糖基化修饰在调节各种生物过程中起着关键作用，包括N-糖基化和O-糖基化，这种修饰是一个动态过程，在细胞活动期间快速循环。其中O-GlcNAc糖基化修饰失调与各种人类疾病有关。目前，类似的调节O-GlcNAc糖基化的酶系统已经在多种细菌中被发现，在多种细菌的生物学功能发挥重要作用，然而，细菌的O-GlcNAc修饰研究仍非常有限。

8月16日，杜宗敏、杨瑞馥团队联合在Nature Communications上发表了题为“A protein O-GlcNAc glycosyltransferase regulates the antioxidative response in Yersinia pestis”的最新成果，研究在鼠疫耶尔森菌中首次发现O-GlcNAc酶系统，并成功鉴定了关键的O-GlcNAc糖基化转移酶（OGT）HmwC。

该研究通过对跳蚤载体（Fv）和哺乳动物宿主（Mh）环境的鼠疫耶尔森菌进行O-GlcNAc糖基化组学分析。确定HmwC作为O-GlcNAc糖基化转移酶促进鼠疫耶尔森菌的O-GlcNAc糖基化，它在结构上与GT41家族的任何现有成员不同，其缺失导致O-GlcNAc糖基化修饰减少，生长减少，并改变毒力特性和应激下的存活。纯化的HmwC可在体外以UDP-GlcNAc作为糖供体修饰靶蛋白。其中一种靶蛋白OsdY可以促进鼠疫耶尔森菌在氧化应激条件下的存活。景杰生物为该研究提供了O-GlcNAc修饰组学技术支持及O-GlcNAc系列抗体。

HmwC催化鼠疫耶尔森菌O-GlcNAc糖基化

研究利用景杰生物提供的O-GlcNAc糖基化修饰泛抗体进行WB实验发现，鼠疫耶尔森菌在不同生长环境下的O-GlcNAc糖基化修饰存在显著差异。

于是，研究者对跳蚤载体（Fv）和哺乳动物宿主（Mh）环境的鼠疫耶尔森菌进行O-GlcNAc糖基化组学分析。GO富集分析发现，在 37 °C下，鼠疫耶尔森菌O-GlcNAc糖基化修饰改变的大多数细菌蛋白是催化蛋白、结合蛋白和转运蛋白。

O-GlcNAc糖基化组学数据分析表明，存在某些蛋白质作为O-GlcNAc糖基化转移酶发挥作用。研究者根据CO92基因组的注释，预测hmwC作为O-GlcNAc糖基化转移酶负责调控鼠疫耶尔森菌的O-GlcNAc糖基化修饰。通过对比4种生长条件下野生型和hmwC突变体（ΔhmwC）的O-GlcNAc糖基化修饰蛋白谱，研究发现ΔhmwC中的蛋白O-GlcNAc糖基化修饰显著降低。该结果表明HmwC作为O-GlcNAc糖基化转移酶，调节鼠疫耶尔森菌O-GlcNAc糖基化修饰。

图1 Fv和Mh条件下鼠疫耶尔森菌O-GlcNAc糖基化差异

HmwC参与调控鼠疫耶尔森菌多项生理功能

为了深入了解HmwC调控的具体生物学功能，研究者对野生型和ΔhmwC的鼠疫耶尔森菌进行了一系列生化实验。

结果发现，在营养限制的TMH培养基中，ΔhmwC的鼠疫耶尔森菌繁殖速率显著降低、对数期延迟和平台期细胞密度降低；ΔhmwC菌株产生的生物膜量是野生型菌株的12倍；ΔhmwC菌株的复制和对过氧化氢的抵抗力均增加。此外，与野生型菌株感染的小鼠相比，感染ΔhmwC的小鼠症状发作和死亡率略早，且小鼠的细菌计数比野生型感染小鼠高1到2个数量级。总之，以上结果证明，HmwC缺失导致鼠疫耶尔森菌生长延迟、生物膜形成能力增强、胞内存活率提升和毒性提高。

图2 HmwC参与调控鼠疫耶尔森菌的胞内存活、生物膜形成和毒力

野生型和ΔhmwC菌株的O-GlcNAc糖基化组学分析

进一步的，研究对在Fv和Mh条件下的野生型鼠疫耶尔森菌和ΔhmwC的细菌总蛋白进行了O-GlcNAc糖基化修饰组学分析，结果发现，野生型与ΔhmwC菌株之间的O-GlcNAc糖基化蛋白及其位点的丰度均存在显著差异。在Fv条件下，ΔhmwC菌株中103种蛋白质的丰度显著增加，而77种蛋白质的丰度显著降低；在Mh条件下，123种蛋白质显著增加，61种蛋白显著降低。

值得注意的是，KEGG信号通路分析发现，参与硫代谢、生物膜形成、细菌分泌系统和ABC转运的蛋白在Fv和Mh条件下均有富集；而参与碳固定途径和丙酮酸代谢的蛋白仅在Fv条件下富集，参与C5支链二元酸代谢、蛋白质输出和氧化磷酸化途径的蛋白仅在Mh条件下富集。

图3 Fv和Mh条件下野生型菌株和ΔhmwC的O-GlcNAc糖基化组学比较分析

HmwC调控OsdY的O-GlcNAc糖基化修饰

接下来，研究者推测ΔhmwC中O-GlcNAc糖基化丰度显著降低的氧化应激防御蛋白OsdY可能为HmwC的潜在底物。质谱分析结果显示，OsdY的Ser-83和海藻酸解酶（AlgL）的Ser-5发生了O-GlcNAc糖基化修饰。

为了评估HmwC是否催化OsdY的O-GlcNAc糖基化，研究以UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖或 UDP-GlcNAc作为糖供体，对HmwC和OsdY进行了体外糖基化测定。结果证明HmwC利用UDP-GlcNAc作为糖基化底物的供体，二者之间存在稳定、高亲和力的结合。

明确糖基化底物供体后，研究者证实了在UDP-GlcNAc存在时，HmwC可促进OsdY发生O-GlcNAc糖基化修饰，而当Ser-83残基突变为Ala时，OsdY的O-GlcNAc糖基化修饰完全消失，且OsdY和AlgL的O-GlcNAc糖基化修饰水平与HmwC的浓度成正比。这些结果表明HmwC调控鼠疫耶尔森菌的O-GlcNAc糖基化修饰。

此外，研究还发现HmwC Asp-217发生突变时，HmwC和OsdY之间的亲和力显著降低了约60%；相比之下，HmwC His-276突变不影响二者结合，但OsdY的O-GlcNAc糖基化修饰消失，确定His-276是HmwC糖基转移酶活性的关键催化位点。

最后，基于OsdY的氧化应激防御注释，研究者证实了OsdY参与鼠疫耶尔森菌的抗氧化应激功能，并且Ala取代OsdY Ser-83消除了其抗氧化活性。

图4 HmwC作为O-GlcNAc转移酶对OsdY和AlgL发挥作用

综上所述，本研究通过O-GlcNAc糖基化修饰组学发现HmwC作为O-GlcNAc糖基转移酶在鼠疫耶尔森菌中调控O-GlcNAc糖基化修饰，且HmwC缺失导致鼠疫耶尔森菌生长延迟、生物膜形成能力增强、胞内存活率提升和毒性提高。此外，研究还确定了几种潜在的HmwC底物。并进一步提供了支持两种蛋白Yp_3614和Yp_0610功能性O-GlcNAc糖基化的证据，这两种蛋白分别被称为耶尔森菌的氧化应激防御蛋白(OsdY)和海藻酸解酶(AlgL)。总的来说，研究揭示了HmwC介导的O-GlcNAc糖基化在调节鼠疫耶尔森菌的抗氧化反应中起关键作用。

图5 本研究流程

景杰评述

研究从鼠疫耶尔森菌传播过程的环境差异出发，利用O-GlcNAc糖基化修饰组学分析鼠疫耶尔森菌的修饰差异，利用这种差异首次发现了鼠疫耶尔森菌内的O-GlcNAc转移酶，并揭示了其调控鼠疫菌生存机制。类似的案例还有：曹雪涛院士团队运用O-GlcNAc糖基化修饰组学，首次揭示了M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是肿瘤微环境中葡萄糖摄取能力最强的免疫细胞亚群，该过程可促进肿瘤转移和化疗耐药，并首次发现了定位于溶酶体的O-连接的N-乙酰葡萄糖胺转移酶（点击链接详细阅读：Cancer Cell重磅！曹雪涛/张迁团队揭示O-糖基化修饰介导的促肿瘤转移和化疗抵抗新机制）。本文的发表再次印证了O-GlcNAc糖基化修饰组学对揭示肿瘤转移和细菌生存具有重要的研究意义和发展潜力。

值得一提的是，近年来关于微生物的生理功能、代谢途径等深层机制的研究中，翻译后修饰、新型酰化修饰图谱越来越受到科研工作者的关注和重视。乳酸化等新型修饰及图谱研究作为近期的研究Top热点关键词，为病原宿主互作、菌群致病机制、寄生虫感染机制和病菌耐药机制等研究提供了新的突破口。例如：

研究运用乳酸化修饰组学，首次描绘了大肠杆菌中Kla蛋白质组的特征图谱，并进一步揭示了乳酸化介导的细菌生长与能量代谢的新机制（点击链接详细阅读：Nat Comm | 张锴/许丽艳团队首次报道原核生物中乳酸化修饰调控因子）。
文章以玫瑰孢链霉菌为模型，发现各种代谢途径中的关键酶上存在广泛的巴豆酰化修饰，并进一步鉴定到链霉菌中巴豆酰化修饰调控酶、和关键修饰底物，深入揭示了巴豆酰化修饰在链霉菌代谢中的调控作用（点击链接详细阅读：Nature子刊：浙大李永泉/毛旭明组揭示修饰“黑马”巴豆酰化，站细菌代谢调控绝对“C位”）
研究运用磷酸化修饰组学技术揭示了稻瘟病菌侵染过程中基于时间序列的磷酸化修饰全局性变化，提供了迄今为止对真菌病原体感染过程中最全面的磷酸化修饰分析，并为运用磷酸化修饰组学方法鉴定新的磷酸化作用靶点提供了范例（点击链接详细阅读：Cell | 首张时间维度的稻瘟病菌侵染过程的磷酸化修饰图谱）。

景杰生物可为您提供“能同步获取糖基化位点及其对应的糖型完整信息，有效地重建糖链与糖基化位点之间的对应联系”的专业的N-/O-糖基化修饰组学分析服务。多年来的潜心研究，让我们积累了丰富的项目经验，也使得我们具有如下优势，包括：信息完整（可提供糖蛋白+糖基化修饰位点+完整糖链信息）、灵敏度高（使用Exploris 480、HF-X等高分辨率质谱仪）、质量保证（临床大队列项目实测验证）、深度分析（创新修饰多组学，深入挖掘信息）。可广泛应用于生理机制研究、病理研究、疾病生物标志物等。

参考文献：

Shiyang Cao, et al. 2024. A protein O-GlcNAc glycosyltransferase regulates the antioxidative response in Yersinia pestis. Nat Commun.

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