过度饮酒是世界各国晚期肝病及肝脏相关住院和死亡的主要原因，酒精占所有肝病死因的50%。酒精性肝病（ALD）是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病，也是我国常见的肝脏疾病之一。酒精性肝炎（Alcohol-associated Hepatitis，AH）是ALD的一种急性表现，具有较高的短期死亡率（28 d时为30%-40%），日益受到关注。肠道菌群广泛影响人体生理功能。肠道菌群失调已成为慢性炎症性疾病发病中最重要的环境因素之一。而肝脏是最早发现的自身免疫性攻击部位之一。2019年国际权威期刊Nature正刊报道了全球肠道菌群研究大牛Bernd Schnabl教授团队研究成果：酒精会通过诱导肠道菌群失调，引发肠道炎症和上皮屏障功能障碍，进一步加剧肝脏免疫反应和炎症。近日，Bernd Schnabl教授团队再次在消化领域国际顶级期刊Gut（IF=23 ）上发表了题为“Faecal proteomics links neutrophil degranulation with mortality in patients with alcohol-associated hepatitis”的最新成果。该研究运用宏蛋白质组学对80例酒精性肝炎患者、20例酗酒患者（酒精使用障碍，AUD）的粪便样本进行分析，筛选到关键的差异蛋白：与中性粒细胞功能相关的MPO蛋白，并通过独立验证队列该蛋白在预测患者预后死亡上的潜力。这一发现可以预测患者短期生存，并可作为预后的非侵入性标志物。酒精性肝炎是酒精使用障碍（AUD）患者中常见的并发症，大约25%的酒精使用障碍患者会发展为酒精性肝炎。为了评估酒精性肝炎患者粪便蛋白质组的变化，研究人员对AH患者（N=80）和AUD患者（N=20）的粪便样本进行了宏蛋白质组学研究，并与已发表的对照组数据（N=19）进行对比分析。PCA主成分分析结果显示，AH组和AUD组与健康对照组有明显的分离，但AH组和AUD组之间没有显著差异(图1A和B)。
为了更好地表征PCA中分离的蛋白质，研究首先筛选出具有显著差异的261个蛋白质，其中有12种蛋白质表现出与酒精相关肝病进展相关的进行性增加或减少(图1D)。有趣的是，8种增加的蛋白质（MPO、CTSG、HBB、LTF、LAMP1、ORM2、HBD、IGLV7-46）中有6种是中性粒细胞功能和颗粒的一部分，而4种减少的蛋白质（NEB、MYL11MYL1、ATP2A1）都与肌肉代谢有关(图1D)。其中髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO) 是中性粒细胞的功能标志和激活标志，作为抗菌剂负责在吞噬细胞内杀灭微生物。
图1 对照组 、酒精使用障碍和酒精相关性肝炎患者的粪便样本蛋白表达差异分析粪便中性粒细胞而非肌肉相关蛋白可预测AH患者的生存率
进一步地，研究对上述12个差异表达蛋白进行了分层聚类分析，确定了三个簇：肌肉蛋白、中性粒细胞颗粒蛋白和其他蛋白质(图2A)。此外，还分析了这些关键蛋白丰度与临床、组织学和其他参数之间的相关性(图2B)。为了检验关键蛋白MPO对于疾病的预测能力，研究根据患者粪便样本中MPO蛋白的表达水平(阈值6.38)将其分为两组。MPO水平超过6.38的AH患者MELD-Na评分较高(图2C)。从60天生存率角度分析，MPO水平高于6.38的AH患者生存率（53.8%）显著低于MPO水平低于6.38的AH患者（79.72%）(图2D)。然而，180天生存率在两组间无显著差异。接下来，作者又根据伴肌动蛋白Nebulin表达水平（阈值4.33）将患者分组，低于该阈值的AH患者MELD-Na评分较高(图2E)，但60天和180天死亡率在两组间无显著差异(图2F)。综上所述，AH患者中与肌肉代谢相关的粪便蛋白丰度较低，而中性粒细胞脱颗粒的蛋白增加，并与疾病严重程度和预后相关。图2 在AH患者中，粪便蛋白组与疾病严重程度和生存相关研究根据蛋白质的功能作用对蛋白质进行聚类分析，发现中性粒细胞脱颗粒途径在AH和AUD患者中显著上调，约22.5-40%的上调蛋白参与该途径。功能富集分析显示，AH患者中与吞噬和体液免疫反应相关的蛋白质分别占17.5%和16.25%。总之，研究确认了中性粒细胞脱颗粒途径与AH患者粪便蛋白质组的显著关联性。![]()
图3 AH患者粪便蛋白在中性粒细胞脱颗粒途径中显著富集在AH患者的验证队列中，粪便MPO水平可预测60天死亡率
为了寻找AH患者的死亡预测的生物标志物，研究比较了60天内死亡的AH患者和存活者的粪便宏蛋白组数据，筛选到大多数显著上调蛋白在中性粒细胞脱颗粒通路中富集（图4A），并将目标确定为与中性粒细胞的功能激活相关的蛋白MPO。为了验证MPO蛋白的预测能力，研究重新收集了一批样本，在第二个独立的多中心队列（N=70）中使用ELISA评估粪便样本中MPO蛋白的表达水平。该队列的MELD评分中位数为25，观察到的60天和180天死亡率分别为19%和27%。研究根据阈值（0.074 ng MPO/mg蛋白）将患者分为两组，结果显示高MPO表达水平与60天生存率显著相关，高MPO组的生存率低于低MPO组（图4B）。然而，高MPO组与低MPO组在180天的长期生存率无显著差异。总之，研究确认了粪便中MPO表达水平可预测60天内的短期生存，证实了粪便样本中MPO表达水平在预测AH患者短期生存中的潜力。![]()
图4 粪便中MPO蛋白表达水平可预测AH患者60天死亡率综上所述，该研究首次利用宏蛋白组描绘了酒精性肝炎患者（AH）的粪便蛋白质组特征。研究发现健康对照组与酒精性肝炎患者的粪便样本之间存在明显的蛋白质组学差异，其中最为显著的变化是与中性粒细胞功能和脱颗粒相关的蛋白质上调。与中性粒细胞功能相关的MPO蛋白在AH患者的粪便样本中显著升高。这种升高不仅与疾病的严重程度相关，还与较高的60天死亡率相关，因此粪便中的MPO蛋白被认为是预测AH患者60天死亡率的生物标志物。此外，粪便中的肌肉蛋白水平降低，这与AH患者肌肉减少症和肌肉萎缩的患病率相一致。该研究揭示的与肝病相关的肠道微生物组蛋白的变化，为精准医疗提供了新的手段，促进了新的诊断工具和治疗策略的开发，从而提高肝病患者的预后。肠道菌群失调已成为慢性炎症性疾病发病中最重要的环境因素之一，特别是消化系统疾病、代谢综合症、肝病和肠道微生物失调等。因此如文章中所示，大队列的宏蛋白质组学研究及宏修饰组学技术，能够对不同疾病患者的肠道菌群进行系统解析，从而揭示宿主-微生物群互作机制，并进一步透视疾病发生发展的机制，并为早期诊断和治疗提供线索。此外，研究发现，肠道菌群分泌的代谢产物能够影响宿主细胞。例如：总的来看，我们可以得出结论，微生物组的蛋白质组学研究正处于快速发展之中，展现出广阔的应用前景和潜力。Kreimeyer H, et al. 2024. Faecal proteomics links neutrophil degranulation with mortality in patients with alcohol-associated hepatitis. Gut.
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