iScience | 上海药物所黄河：SIRT1/3是乳酸化修饰“eraser”

学术 2024-10-09 09:02 浙江

景杰生物 | 报道

以乳酸、琥珀酸、巴豆酸、β-羟基丁酸等为代表的代谢物，除了作为能源和代谢中间产物外，还可以介导蛋白质翻译后修饰（PTMs）发挥信号传导功能，从而在多种生理和病理过程中起着关键作用。近年来研究发现，由乳酸衍生的赖氨酸乳酸化（Kla）作为一种新型的翻译后修饰，连接了细胞代谢和表观遗传调控。此外，组蛋白和非组蛋白上的乳酸化修饰已被证明参与癌症、炎症、胚胎发育、神经精神疾病、同源重组修复等过程。

识别PTMs的关键调控元件，如“writer”、“erasers”和“reader”，对于理解它们的功能至关重要。其中，SIRT1和SIRT3是sirtuins家族成员，它们是依赖NAD+的去乙酰化酶，参与调控多种细胞过程，包括细胞应激反应、能量代谢和细胞衰老等。先前的研究表明，SIRT1和SIRT3能够去除组蛋白上的乳酸化修饰，但其对非组蛋白乳酸化修饰的调控作用尚不明确。此外，由于SIRT1和SIRT3在细胞中的底物特异性、功能差异性以及在细胞代谢特别是糖酵解过程中的重要作用机制，因此它们仍是修饰调控的研究重点。

近日，中国科学院上海药物研究所黄河教授团队在iScience上在线发表了题为“SIRT1/SIRT3 are robust lysine delactylases and SIRT1-mediated delactylation regulates glycolysis”的最新研究成果。该研究揭示了SIRT1和SIRT3是组蛋白和非组蛋白Kla的"eraser"，且具有不同的调控模式和底物特异性，加深了我们对乳酸化功能机制的理解。

通过对野生型(WT)、SIRT1 敲除(knockout, KO)和SIRT3 KO的HepG2细胞进行了乳酸化和乙酰化修饰组学检测，研究分别鉴定到8075个Kla位点和3515个Kac位点。分析发现，SIRT1和SIRT3是组蛋白和非组蛋白Kla的"eraser"，且具有不同的调控模式和底物特异性。进一步地，糖酵解过程中的α烯醇酶（ENO1）的K228la受到SIRT1/SIRT3调控，糖酵解丙酮酸激酶2（PKM2）的K207la则受SIRT1的独特调节。此外，PKM2-K207la通过阻碍PKM2功能来限制糖酵解和细胞增殖。景杰生物为该研究提供了15款乳酸化/乙酰化系列修饰抗体。

SIRT1、SIRT3是组蛋白和非组蛋白乳酸化的“eraser”

先前研究发现p300是组蛋白乳酸化的“writer”，HDAC1-3、SIRT2是组蛋白乳酸化的“eraser”，但是否存在其他负责组蛋白和非组蛋白乳酸化的“eraser”仍未可知。

研究者首先运用景杰生物提供的乳酸化修饰泛抗体进行体外实验发现，SIRT1-3对组蛋白表现出显著的去乳酸化酶活性。通过在HepG2细胞中构建SIRT1 KO和SIRT3 KO细胞系，检测乳酸化水平发现，SIRT1 KO和SIRT3 KO细胞中组蛋白和非组蛋白中的Kla水平显著升高。这表明SIRT1、SIRT3是乳酸化调控的“eraser”。

图1 乳酸化调控“eraser”的体内和体外筛选

SIRT1和SIRT3对Kla显示出不同的调控模式

进一步地，为了深入了解SIRT1/SIRT3靶向的Kla底物，以及SIRT1和SIRT3对 Kla和Kac的不同调节机制，研究者对WT、SIRT1 KO和SIRT3 KO的HepG2细胞进行了乳酸化修饰组学和乙酰化修饰组学的检测，结果鉴定到2422个蛋白上的8075个Kla位点和1680个蛋白上的3515个Kac位点。值得注意的是，该结果显著扩展了Kla底物图谱，除组蛋白外，还包括了大量的非组蛋白底物。

研究者分析WT、SIRT1 KO和SIRT3 KO HepG2细胞的乳酸化修饰位点发现，SIRT1和SIRT3敲除后影响了不同的底物。GO富集分析发现，SIRT1、SIRT3靶向的Kla位点参与不同的生物学过程。此外，二者在调控的Kla +1位点的氨基酸偏好性也不同，这些结果表明，SIRT1和SIRT3对Kla显示出不同的调控模式。

图2 SIRT1 KO和SIRT3 KO HepG2细胞中整体赖氨酸乳酸化和乙酰化的差异分析

ENO1-K228la是SIRT1/3的靶标，PKM2-K207la受SIRT1的特异调节

接下来，研究发现受SIRT1和SIRT3调节的Kla位点主要富集在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、碳代谢、糖酵解/糖异生和氨基酸的生物合成等途径。通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，研究者锁定到PKM2、ENO1等10个关键蛋白。

结合乳酸化修饰组学数据和位点突变实验，研究证实了ENO1的乳酸化主要发生在K228位点。免疫共沉淀结果表明ENO1可以和SIRT1、SIRT3相互作用，且体外酶催化实验结果显示ENO1-K228la是SIRT1和SIRT3的直接调控位点。

此外，乳酸化修饰组学数据表明，PKM2-K207la是SIRT1的潜在靶标，进一步的体外突变实验、免疫共沉淀、遗传密码扩增技术结果表明SIRT1可与PKM2相互作用并降低K207特异性乳酸化水平。然而，SIRT3对PKM2 K207乳酸化水平的影响相对较小。以上结果提示，ENO1-K228la是SIRT1/SIRT3的靶标，PKM2-K207la受SIRT1的特异调节。

图3 ENO1-K228la是SIRT1/3调节的靶标

PKM2-K207la通过阻碍PKM2功能来限制糖酵解和细胞增殖

PKM2以同源四聚体和同源二聚体形式存在，二者的比例在调节细胞增殖、存活和转化中起着至关重要的作用。为探究K207la是否参与PKM2从四聚体向二聚体的转化，研究首先对转染了Flag-PKM2 WT、K207R和K207la的HEK293T细胞进行免疫沉淀和丙酮酸酶活性的测定，结果发现PKM2 K207la严重地抑制了四聚体的形成，且表现出最低的丙酮酸激酶活性。此外，亚细胞定位结果显示，PKM2-K207的乳酸化在调节PKM2相互作用中起关键作用，导致不同的亚细胞定位模式。

为了进一步确定PKM2-K207乳酸化对糖酵解的影响，研究首先敲除了HEK293T细胞中的内源性PKM2，再转染Flag标记的PKM2 WT、K207R和K207la，结果发现转染PKM2 K207la的细胞外酸化率（extracellularacidificationrate, ECAR）水平降低、糖酵解受到抑制、细胞的增值率最低。以上这些结果表明，SIRT1调控PKM2-K207的乳酸化通过阻碍四聚体形成和改变细胞内定位来影响其酶活性，从而抑制糖酵解和细胞生长。

图4 PKM2-K207的乳酸化抑制糖酵解并影响细胞生长

综上所述，研究通过乳酸化修饰组学结合乳酸化修饰等系列抗体验证，确定了SIRT1和SIRT3分别是组蛋白和非组蛋白上乳酸化的“eraser”，揭示了二者对乳酸化修饰的不同底物特异性。二者对乳酸化修饰表现出不同的调控模式。受SIRT3特异调控的PKM2-K207乳酸化修饰，在调节代谢途径和细胞增殖也发挥关键作用，加深了我们对乳酸化修饰在表观遗传学之外的研究见解，也为深入研究乳酸化的功能表型和机制奠定了重要基础。

景杰评述

近年来，乳酸因其在细胞代谢中的关键作用，受到多领域研究的广泛重视。由乳酸衍生的乳酸化修饰也在细胞代谢与细胞信号传导、转录和细胞生长的调节之间建立了直接联系，因此，破译其中的“连接密码”，如乳酸调节酶和关键底物，对于了解其对健康和疾病的影响至关重要。本研究发现的SIRT1、SIRT3可作为组蛋白和非组蛋白上乳酸化修饰的“eraser”，可谓是进一步拓宽了乳酸化修饰中参与的酶系统。同时也提示我们，是否还有其他“Writer”、“Reader”、“Eraser”参与其中，将是未来重点关注的研究方向。

值得一提的是，该研究通过乳酸化修饰组学揭示了SIRT1和SIRT3对乳酸化的独特调节模式，且初步探讨了受二者调控的下游因子ENO1和PKM2。那么这两个关键因子的乳酸化修饰又会影响怎样的疾病发生，以及如何影响临床表型，且是否还存在受SITR1/3调控其他下游因子，这些未来都值得深入探讨。

景杰生物作为乳酸化修饰研究的领跑者，在上万例样品中积累了丰富的乳酸化修饰研究经验和实验方案。可提供“从WB预筛选，乳酸化修饰组学分析，到运用丰富的乳酸化修饰位点特异性抗体进行功能验证，再到后续的CUT&Tag分析”等全流程服务。景杰生物PTMab抗体产品具有高特异性、高亲和力、高批间一致性等优势，其应用也多次见刊于Cell、 Nature、 Science等国际顶尖杂志。如果您想了解景杰生物研究产品和服务的更多信息，可咨询景杰生物销售工程师、或拨打科服热线400-100-1145。

参考文献：

Runhua Du, et al. 2024. SIRT1/SIRT3 are robust lysine delactylases and SIRT1-mediated delactylation regulates glycolysis. iScience.

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