景杰生物 | 报道
低氧（hypoxia）是细胞和组织中氧气供应不足的一种状态。低氧在肿瘤发展、心脏病、慢性阻塞性肺病等疾病中扮演着重要角色，并且是许多生理和病理过程的核心因素。由于其重要的研究价值，2019年诺贝尔生理学或医学奖颁发给了三位科学家，以表彰他们在细胞感知和适应氧气供应的分子机制方面的发现。
8月12日，首都医科大学李兵辉及杨传真团队联合在Nature Communications（IF=14.7）上在线发表题为“Hypoxia-induced downregulation of PGK1 crotonylation promotes tumorigenesis by coordinating glycolysis and the TCA cycle”的最新成果，该研究通过巴豆酰化修饰组学技术揭示了低氧条件下PGK1（磷酸甘油酸激酶1）的巴豆酰化水平下降对肿瘤发生的促进作用及其分子机制，其与乳腺癌恶性肿瘤和不良预后相关，为乳腺癌治疗提供了新靶点。景杰生物为该研究提供了巴豆酰化修饰组学、PRM靶向质谱分析技术支持以及巴豆酰化修饰位点定制抗体、巴豆酰化修饰泛抗体支持。
01
巴豆酰化修饰组学发现缺氧条件下PGK1巴豆酰化修饰下调
为了确认缺氧对全局蛋白质巴豆酰化（Kcr）修饰的影响，研究团队对缺氧或常氧条件下的人乳腺癌细胞（MDA-MB231细胞）进行巴豆酰化修饰组学检测。
结果在1241个蛋白中鉴定出3971个Kcr位点，101个蛋白的128个巴豆酰化修饰位点在缺氧条件下发生明显变化，其中PGK1的K131、K156和K220位点上的巴豆酰化修饰在缺氧条件下显著减少，这引起了研究团队的注意。
PGK1是TCA循环中的关键酶，催化 1,3-二磷酸甘油酸 (1,3-BPG) 和 ADP 转化为 3-磷酸甘油酸 (3-PG) 和 ATP，在糖酵解过程中发挥着至关重要的作用（图1）。
图1 巴豆酰化修饰组学结果
02
PRM靶向质谱验证了PGK1的K131/156/220位点可发生巴豆酰化修饰
为了确认修饰组学的结果，研究团队合成了PGK1的三个巴豆酰化修饰位点的多肽，通过内外源谱图重叠的PRM靶向质谱特异性检测了PGK1的巴豆酰化修饰，结果表明PGK1的三个巴豆酰化修饰位点的二级谱结果和保留时间与先前的组学结果一致，进一步证明了PGK1的K131、K156和K220位点可发生巴豆酰化修饰（图2）。
研究团队同时也进行了PGK1的物种间多序列比对，发现PGK1的三个巴豆酰化修饰位点均高度保守。研究团队还构建了PGK1的巴豆酰化修饰位点突变体，发现三位点突变（3KR）的PGK1的巴豆酰化修饰信号完全消失，进一步确认了K131、K156和K220为PGK1的主要巴豆酰化修饰位点（图2）。
图2 PRM靶向质谱和点突变验证PGK1的巴豆酰化修饰位点
03
ECHS1介导缺氧条件下PGK1的巴豆酰化修饰水平下调
为进一步探究缺氧条件下PGK1 Kcr下调的机制，研究团队首先过表达Flag-PGK1，质谱分析确定其相互作用的蛋白。结果显示，PGK1与催化巴豆酰辅酶A水解的ECHS1（烯酰辅酶A水合酶1）存在相互作用，且PGK1-ECHS1的相互作用不受PGK1巴豆酰化位点突变的影响。
研究团队通过Alphafold2预测PGK1和ECHS1的结合界面，确定了四个假定的ECHS1结合位点（Lys133、Asn138、Lys139 和 Lys144），随后通过构建突变体和Co-IP实验证明了这四个位点均为PGK1与ECHS1结合的关键位点。
研究进一步发现，过表达ECHS1会导致PGK1的巴豆酰化修饰水平下调，而去除ECHS1和PGK1的相互作用会导致PGK1的巴豆酰化修饰水平上调，说明ECHS1很可能通过与PGK1相互作用影响了PGK1的巴豆酰化修饰水平。
研究发现缺氧处理后PGK1-ECHS1的相互作用增强，并且ECHS1蛋白表达水平增加，mRNA水平上调。随后研究人员通过CUT&Tag实验发现，缺氧诱导基因的主要调节因子HIF-1α在缺氧条件下与ECHS1启动子结合，促进了ECHS1转录水平上调（图3）。此外，研究发现PCAF为PGK1巴豆酰化修饰的主要修饰酶。
图3 缺氧HIF-1α调控ECHS1转录影响PGK1巴豆酰化修饰水平
04
PGK1巴豆酰化修饰协调线粒体丙酮酸代谢与糖酵解途径
接下来，研究团队探究了PGK1巴豆酰化修饰对其功能的影响。先前研究发现缺氧诱导PGK1 S203位点磷酸化，使得PGK1易位至线粒体，在线粒体中PGK1磷酸化PDHK1 T338位点，进而诱导丙酮酸脱氢酶(PDH)磷酸化和失活，从而抑制线粒体丙酮酸代谢，促进糖酵解。
通过一系列体外和体内实验，研究团队发现PGK1的巴豆酰化修饰并不影响PGK1的糖酵解活性，也不影响PGK1在缺氧条件下的线粒体易位，而是影响了PGK1 S203的磷酸化水平和PDHK1激活。通过耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）实验，研究团队发现抑制PGK1巴豆酰化会抑制线粒体丙酮酸代谢，并促进乳酸的产生（图4）。
图4 PGK1 巴豆酰化对于协调线粒体丙酮酸代谢和糖酵解是不可或缺的
05
低PGK1巴豆酰化水平导致乳腺癌患者不良预后
最后，研究团队探究了PGK1巴豆酰化对细胞增殖和肿瘤生长的影响。细胞集落形成实验、细胞迁移实验、裸鼠成瘤实验和免疫组化等实验表明，PGK1巴豆酰化修饰的下调可促进体外肿瘤细胞的增殖和迁移，并且促进肿瘤生长。
研究团队还将129名乳腺癌患者的生存时间与PGK1的巴豆酰化水平进行了比较，发现低PGK1 K131cr水平的乳腺癌患者预后不良，且ECHS1在肿瘤组织中的表达显著增加(图5)，提示PGK1 K131位点的巴豆酰化可作为乳腺癌的重要诊断指标。
图5 PGK1的低巴豆酰化水平与乳腺癌患者不良预后相关
综上所述，该研究通过对常氧和缺氧条件下的MDA-MB231细胞进行巴豆酰化修饰组学分析，发现并鉴定了糖酵解途径的关键酶PGK1的 K131cr、K156cr和K220cr可发生巴豆酰化修饰，并通过一系列实验展示了缺氧条件下PGK1巴豆酰化修饰的调控机制：缺氧诱导ECHS1表达水平上调，导致细胞内巴豆酰辅酶A含量降低；同时PGK1易位到线粒体并与 ECHS1相互作用抑制了PGK1自身的巴豆酰化水平，促进了PGK1与PDHK1相互作用，导致 PDHK1磷酸化上调，抑制丙酮酸代谢，促进糖酵解，进而促进了乳腺癌肿瘤生长。
图6 本研究机制图
景杰评述
本研究通过巴豆酰化修饰组学及金标准验证体系（内外源谱图重叠的PRM靶向质谱）揭示了PGK1 Kcr是一个协调糖酵解和三羧酸(TCA)循环的信号，或可作为乳腺癌的诊断指标。
值得一提的是，代谢重编程是肿瘤细胞的典型特征之一。细胞通过代谢重编程来适应低氧环境，是一种关键的生物学适应过程，在低氧条件下，细胞激活一系列代谢途径的调整，如增强糖酵解以快速产生能量、调整线粒体功能以减少氧化应激、多样化利用代谢中间产物以支持生物合成和抗氧化、以及促进血管生成以改善氧气和营养的供应。而新型酰化修饰在其中扮演了关键角色，例如：
乳酸化修饰：该研究揭示了缺氧是近视形成中巩膜糖酵解增强、乳酸增多的诱导因素，揭示了糖酵解激活是巩膜缺氧诱导近视形成的关键分子机制，并提供了潜在的近视防控的新靶点与策略（点击链接详细阅读：高糖饮食易致近视！Cell Metab | 温州医科大学揭示巩膜乳酸化修饰介导近视形成）。
巴豆酰化修饰：该研究运用巴豆酰化修饰组学揭示了Nrp1通过巴豆酰化修饰影响线粒体功能，最终促进肾损伤和纤维化（点击链接详细阅读：Nat Commun | 华中科技大学团队巴豆酰化修饰组学揭示肾损伤/纤维化新机制）。
琥珀酰化修饰：该研究运用琥珀酰化修饰组学揭示了琥珀酰辅酶A合成酶SUCLG2在线粒体功能障碍中的作用，阐明了其在肺腺癌(LUAD)中琥珀酰化介导蛋白稳态的机制（点击链接详细阅读：Adv Sci丨琥珀酰化修饰组学揭示SUCLG2调节肺腺癌肿瘤代谢的分子机制）。
丙二酰化修饰：该研究通过丙二酰化修饰组学首次报道了Ago2丙二酰化修饰调控糖尿病源性心肌病的新机制，其可影响与线粒体转运蛋白TIMM17b的结合，导致Ago2向线粒体内的转运减少，增加线粒体活性氧产生，最终损伤心脏功能（点击链接详细阅读：Circulation | 华中科技大学团队揭示Ago2丙二酰化介导糖尿病引发心脏疾病新机制）。
β-羟基丁酰化修饰：该研究通过β-羟基丁酰化修饰组学阐明了生酮饮食通过赖氨酸β-羟基丁酰化修饰调控糖酵解和三羧酸循环等细胞过程，且其可通过影响mTOR信号通路调控癌症代谢（点击链接详细阅读：Nat Metab | 薛宇/贾大团队揭示生酮饮食通过β-羟基丁酰化修饰调控代谢机制）。
以上这些案例强调了新型酰化修饰在代谢重编程介导下的低氧响应、疾病进展中扮演的关键角色。这提示我们新型酰化修饰组学必将是探究癌症进展、疾病进程的重要手段。
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