活体内功能性和血管化人类大脑类器官模型

这项研究的背景是基于人类多能干细胞（hPSC）分化而成的大脑类器官为模拟人类大脑发育和疾病提供了前所未有的机会。尽管体外培养的大脑类器官已经在研究人类大脑发育和复杂疾病方面取得了进展，但它们缺乏体内环境中的微环境、神经回路、血管循环和免疫系统等要素。特别是血管化对于氧气渗透、营养供应和有效的神经前体细胞分化至关重要。因此，研究者们开发了一种将人类大脑类器官移植到成年小鼠大脑中的模型，以提供一个血管化和功能的活体内模型，从而在生理条件下促进疾病建模。

图1展示了将人类大脑类器官植入免疫缺陷小鼠大脑的实验过程和结果。(a) 描述了从人类胚胎干细胞（hESCs）生成GFP（绿色荧光蛋白）标记的大脑类器官并将其植入免疫缺陷小鼠大脑的实验步骤的示意图；(b) 展示了在植入后50天（dpi）从小鼠大脑中取出的GFP+大脑类器官的全貌背视图，其中白色轮廓标出了植入区域，放大的植入区域图像显示了从类器官向宿主大脑生长的神经突（箭头指示）；(c) 呈现了植入大脑类器官后小鼠的总体生存曲线，显示了超过180 dpi（天植入后）的小鼠存活率；(d) 通过免疫荧光和共聚焦显微镜分析了在指定dpi植入的GFP+大脑类器官的冠状切片，显示了植入物在14 dpi时在损伤腔中存活并分布良好，图像显示了GFP和人类核抗原（hNuclei）的免疫荧光染色，证明了植入物的存活和分布；(e) 植入物的免疫染色显示了GFP、背侧前脑祖细胞标记PAX6和深层亚皮层神经元标记CTIP2，放射状排列的细胞（箭头，左面板）代表了PAX6+ VZ-L区域（点状白线）。图中的n = 4动物在b中，n = 3动物在d和e中。所有图像中细胞核都用DAPI进行了对比染色。比例尺：b中的1 μm，d中的100 μm，e中的20 μm。

图2 通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析，展示了植入大脑类器官在不同时间点的存活和分化情况。(a) 展示了在14天植入后（dpi）的类器官中，神经前体细胞（NPCs）标记SOX2和成熟神经元标记NeuN的共存，但SMI312阳性的成熟神经元数量较少。到了50 dpi，SOX2表达区域减少，而NeuN阳性细胞增多，SMI312阳性区域扩大。通过定量分析，与14 dpi相比，50 dpi时NeuN阳性细胞的百分比显著增加，表明类器官在体内环境中的成熟和/或存活得到了增强。(b) 通过与体外培养的类器官相比，50 dpi的植入类器官显示出更高比例的NeuN阳性细胞，表明体内环境促进了类器官的细胞成熟。(c) 展示了与体外培养的类器官相比，植入类器官中SOX2和NeuN阳性细胞的百分比。(d) 通过GFP和人类特异性GFAP（hGFAP）的免疫染色，观察到随着时间的推移，类器官中星形胶质细胞的分化和数量增加。(e) 在50 dpi和90 dpi时，通过Olig2的免疫染色确认了类器官中存在少突胶质细胞。(f) 通过Iba1的免疫染色显示，人类植入物中含有不与GFP共定位的微胶质细胞，表明这些细胞来自宿主。(g) 通过突触前标记物Synapsin I和突触后标记物PSD95的双重免疫荧光染色，显示了类器官内突触连接的形成。图中的数据代表了在不同时间点收集的独立动物的平均值，并通过统计测试进行了显著性分析。比例尺：a中的100 μm，d-f中的50 μm，f（右图）中的5 μm，g中的5 μm。

图3 通过共聚焦显微镜成像展示了植入的大脑类器官向宿主小鼠大脑发出轴突投射并与宿主大脑建立突触连接的情况。(a, b) 分别展示了90天植入后（dpi）小鼠大脑中GFP阳性类器官的冠状切片，图像显示了类器官与宿主大脑皮层区域和胼胝体（CC）的大量轴突生长和整合。(c) 展示了宿主皮层中GFP、人类特异性突触小泡蛋白（hSyn）和突触后密度蛋白95（PSD95）的免疫染色单焦平面共聚焦图像，其中hSyn和PSD95的共定位（箭头指示）表明类器官轴突与宿主大脑之间存在突触连接。(d) 展示了GFP信号和hSyn及仅与PSD95共定位的点的Z-stack 3D重建，进一步证实了突触连接的存在。(e) 通过定量分析90 dpi植入小鼠大脑宿主皮层区域的hSyn、PSD95和hSyn/PSD95共定位点的数量，结果以平均值 ± 标准误差（s.e.m.）呈现，并且对区域进行了归一化处理。所有图像中细胞核都用DAPI进行了对比染色，比例尺：a, b中的50 μm；c, d中的5 μm。

图4 展示了植入的大脑类器官发展出功能性血管系统，并在宿主小鼠大脑中观察到血管化和减少的细胞凋亡。(a) 描述了通过活体双光子显微镜成像技术观察类器官移植物的血管动态的成像方法。(b) 通过宏观观察展示了接受者血管系统对移植物的血液灌注动态。(c) 展示了在指定时间点对CD31和hNuclei的共免疫染色，证明了血管网络在移植物中的生长。(d) 通过TUNEL染色展示了植入的类器官和体外培养的类器官在指定阶段的细胞凋亡情况，并通过定量分析显示植入后细胞凋亡的减少。(e-g) 通过颅窗对血管进行活体双光子成像，展示了在不同植入时间点（30 dpi的e，120 dpi的f）后，通过德克萨斯红-地克司蓝（TexasRed-dextran）灌注的血管网络的三维重建和单个z平面的视图，证明了移植物内血管网络中血液流动的存在。所有图像中细胞核都用DAPI进行了对比染色，比例尺：b中的1 mm；c, d中的50 μm；e-g中的100 μm。

图5 利用双光子成像技术揭示了植入的大脑类器官中神经元活动的模式。(a) 展示了用于监测类器官移植物神经元活动的双光子成像系统示意图。(b) 展示了在78 dpi时，通过双光子成像捕获的Ca2+瞬变期间，类器官中Ca2+浓度高低不同阶段的代表性图像，以及钙传感器荧光强度在神经元活动期显著增强的情况。(c) 展示了168 dpi时表达jRGECO1a的神经元的典型视野，以及这些细胞的代表性ΔF/F钙迹。(d) 展示了来自(c)中视野的细胞的钙迹，注意这些细胞活动的节律性和完美的同步性。(e) 展示了同一小鼠在植入后不同时间点的代表性ΔF/F迹。(f) 展示了在不同成像会话中可以对移植物中的相同细胞进行成像。这些结果表明，植入的类器官中存在同步化的神经网络活动，并且可以对这些活动进行长期观察。图中的n = 3只植入动物在b-e中，n = 1只植入动物在f中。比例尺：b, c中的10 μm。

图6 展示了在植入的大脑类器官中进行的活体电生理记录，揭示了类器官神经元的电活动和网络连接。(a) 展示了用于记录类器官移植物的活体多电极阵列记录系统的示意图。(b) 展示了从115 dpi植入的类器官中的单个神经元记录到的动作电位（尖峰）的波形。(c) 展示了来自(b)中同一神经元的波形的主成分分析（PCA），用于区分不同的神经元。(d) 展示了从115 dpi植入的类器官中不同深度（从上到下：-0.6 mm，-1.5 mm，-1.8 mm，和-2.0 mm）的单个神经元的放电率变化，箭头表示异氟醚（一种麻醉剂）的开关时间。(e) 展示了(d)中不同深度的神经元的尖峰散点图，每个垂直条代表一个单独的尖峰。(f) 展示了(d)中神经元对的交叉相关性，其中在-1.5 mm和-2.0 mm深度的神经元对显示出强烈的相关活动，表明晚期植入的类器官具有更活跃和协调的神经网络。图中的n = 3只植入动物。

本研究成功开发了一种将人类大脑类器官移植到成年小鼠大脑中的活体模型，这些移植的类器官在小鼠大脑中显示出逐步的神经元分化和成熟、胶质细胞生成、微胶质细胞的整合以及轴突向宿主大脑多个区域的生长。通过活体双光子成像技术，研究者们观察到类器官内形成了功能性的神经元网络和血管。此外，结合活体胞外电生理记录和光遗传学技术，研究揭示了类器官内部的神经元活动以及类器官与宿主大脑之间的功能性突触连接。这些发现表明，人类大脑类器官与活体动物大脑的结合为模拟人类大脑发育和疾病提供了一个具有生理条件的平台，有助于在接近真实生理环境中研究疾病机理和药物测试，并可能对神经发育、神经精神和神经退行性疾病的机制研究以及细胞治疗策略的开发具有重要意义。

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