Nature | 大牛刘如谦，更安全、更有效的基因编辑疗法

文摘 2024-11-17 07:51 上海

基因编辑技术的发展史可追溯至20世纪60年代限制性内切酶的发现，随后DNA克隆技术的出现使得基因操作成为可能。90年代，锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活子样效应子核酸酶（TALENs）的开发为特定DNA序列的编辑提供了新工具。2012年，CRISPR-Cas9系统的发现引发了基因编辑技术的革命，使得基因编辑更简便、高效，并迅速应用于疾病研究、作物改良和潜在治疗中。同时，基因编辑技术的伦理和监管问题也成为公众讨论的焦点，而基因编辑疗法的临床试验也逐步展开，标志着基因编辑技术从基础研究向临床应用的重要转变。

随着基因编辑技术的发展，特别是CRISPR-Cas9系统的兴起，为治疗遗传性疾病提供了前所未有的机会。然而，将基因编辑工具有效地传递到体内特定细胞类型一直是一个挑战。病毒样颗粒（VLPs）因其能够高效地将蛋白质、RNA和其他基因编辑组件传递到细胞中而受到关注。但是，现有的VLPs在生产和转导效率方面存在限制。

为了克服这些限制，麻省理工学院和哈佛大学博德研究所David R. Liu、Aditya Raguram研究团队开发了一种新的定向进化系统，通过该系统可以改善VLPs的这些属性，从而提高它们作为基因编辑传递载体的潜力。这项工作为设计更安全、更有效的基因编辑疗法提供了新的策略。详细内容以“Directed evolution of engineered virus-like particles with improved production and transduction efficiencies”为题发表在《Nature Biotechnology》上。

【主要内容】

图1 条形码eVLP进化系统的验证

该系统利用独特的条形码sgRNA标记每个eVLP变体，通过生产选择和转导选择实验，证明了条形码富集与所需属性的eVLP变体相关。在生产选择中，功能性Gag-ABE构建与非功能性ABE构建（无Gag）被用来生成含有不同条形码的eVLP，结果显示功能性构建的条形码在eVLP中富集，而非功能性构建的条形码则减少。在转导选择中，野生型VSV-G包膜蛋白与受损的VSV-Gmut包膜蛋白被用来评估eVLP对细胞的转导效率，结果显示野生型VSV-G的条形码在成功转导的细胞中富集。这些结果共同验证了条形码eVLP系统的有效性，并为进一步的eVLP进化和优化提供了基础。

图2 条形码eVLP衣壳选择

研究人员构建了一个包含3,762个MMLV Gag蛋白衣壳突变体的条形码eVLP衣壳库，并进行了两个独立的筛选：一是提高生产效率，二是提高对HEK293T细胞的转导效率。通过高通量测序分析，研究者确定了在生产和转导筛选中富集的条形码，这些富集的条形码对应于支持改善eVLP性能的衣壳突变体。图中展示了所有衣壳突变体在生产和转导筛选中的平均富集值，其中红色点代表v4 eVLP的典型衣壳，蓝色点代表被选为进一步表征的突变体。这些结果揭示了不同衣壳突变对eVLP生产和转导效率的影响，并为开发具有提高性能的eVLP变体提供了重要信息。

图3 衣壳突变的组合提高了eVLP的效力

研究者们首先将单个衣壳突变体分别引入Gag-ABE构建中，并与GagQ226P-Pro-Pol搭配，发现多种突变体相比v4 eVLPs在效力上有所提升。进一步，研究者们测试了不同组合的突变体在Gag-ABE和Gag-Pro-Pol中的搭配效果，发现特定的C末端突变体与GagQ226P-Pro-Pol搭配时表现出最佳的效力。通过在不同剂量下评估这些eVLP变体在HEK293T细胞中的腺嘌呤碱基编辑效率，确认了v5 eVLPs（特别是GagC507V-ABE + GagQ226P-Pro-Pol组合）在效力上实现了2至4倍的提升。此外，研究还证明了这些改进的eVLP变体能够提高在小鼠N2A细胞中的基因编辑效力，证实了v5 eVLPs在不同细胞类型中的改进性能。

图4 v5 eVLPs提高了人原代HSPCs的碱基编辑能力

通过比较v4和v5 BE-eVLPs在不同剂量下的效果，研究发现v5 BE-eVLPs在所有测试剂量下均显示出比v4 BE-eVLPs更高的目标腺嘌呤碱基编辑效率，平均提高了2.6倍的效力。特别是在最高测试剂量下，v4 BE-eVLPs达到的最大编辑效率可以通过使用16倍更低剂量的v5 BE-eVLPs实现。此外，与未处理的HSPCs相比，经v4或v5 eVLPs处理后48小时的总活细胞数没有显著差异，表明eVLPs对HSPCs的活力没有显著影响。这些结果进一步证明了v5 eVLPs在治疗相关细胞类型中的改进性能和应用潜力。

图5 v5 eVLPs的特性

研究发现，v5 eVLPs中的Q226P和C507V突变导致了更高效的货物释放和更多的ABE蛋白及sgRNA分子的包装，这可能有助于提高其转导效力。冷冻电镜图像显示，与v4 eVLPs相比，v5 eVLPs的衣壳结构发生了显著变化，缺少成熟的衣壳形态，表明成熟的衣壳对于eVLPs传递BE RNP货物并非必需。此外，v5 eVLPs的颗粒直径略大，这可能使它们能够每个颗粒包装更多的货物分子。这些结构和组成的变化共同促成了v5 eVLPs相比v4 eVLPs在功能上的提升。

【全文总结】

本文介绍了一种创新的定向进化系统，用于改进工程化病毒样颗粒（eVLPs）的生产和转导效率。通过在eVLPs中嵌入带有唯一条形码的指导RNA（sgRNAs），研究者们能够追踪并选择具有所需属性的eVLP变体。应用此系统，他们开发了第五代（v5）eVLPs，这些eVLPs在哺乳动物细胞中的交付能力比前一代（v4）提高了2至4倍。v5 eVLPs的改进包括更高效的RNA和蛋白质包装、改进的货物释放以及结构上的变化，这些变化优化了颗粒的成熟过程和细胞转导。研究还验证了v5 eVLPs在原代人类造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中的应用潜力，显示了其在治疗严重血液疾病中的效率和安全性。这项工作不仅展示了eVLPs在基因编辑和治疗蛋白传递中的潜力，也为未来设计更高效、安全的基因编辑工具提供了新策略。

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