CAR的结构、其表达水平和信号转导特性是工程化T细胞功能和持久性的关键决定因素。增强CARs的功能持久性可以改善临床结果。
T细胞在抗原暴露后，会分化为记忆和效应细胞。效应T细胞被赋予强大的细胞毒性功能，但表现出有限的持久性。记忆细胞显示出较少的效应功能，但被赋予更大的功能持久性，可能作为效应T细胞的补充来源。这些转变伴随着表观遗传变化，有助于定义不同T细胞的转录和功能特征。在CAR T细胞中破坏DNA甲基化调节因子DNMT3a和TET2可以改善记忆细胞的形成，并被认为可以增强抗肿瘤效果。对组蛋白尾部的修饰提供了对位点可及性的另一层控制。
Tri-methylation of H3 Lysine 9 (H3K9me3)作为真核细胞内最重要的抑制性组蛋白修饰，对于抑制基因组内广泛存在的重复序列和维持基因组稳定性至关重要。主要催化H3K9me3的三种蛋白是SUV39H1、SUV39H2和SETDB1。作者团队在本篇文章中，重点关注SUV39H1，据报道可知，它可以控制记忆细胞导效应细胞的转变。因此，作者团队假设破坏SUV39H1可以改善基于CD28的人类CAR T细胞的功能持久性和抗肿瘤效果，从而进行了一系列的实验研究。
图1展示了通过CRISPR/Cas9系统对健康捐赠者分离的T细胞进行SUV39H1基因编辑的过程和结果。图A描述了H3K9me3 FACS实验的示意图。图B和图C展示了gRNA编辑效率和编辑位点的分布，其中最佳候选gRNA实现了约80%的编辑效率。图D通过蛋白质水平的Western blot验证了SUV39H1的破坏。图E和图F显示了编辑后T细胞中H3K9me3水平的全面下降。这些结果表明，SUV39H1的破坏导致了T细胞中H3K9me3水平的全面减少。
图2展示了SUV39H1基因破坏对CAR-T细胞功能的影响。图A描述了CAR-T细胞生成方案和NALM6小鼠模型的示意图。图B显示了在1928z CAR-T细胞治疗下小鼠的生存率（左图）和肿瘤负担（右图），其中1928z CAR-T细胞剂量为2e5，未处理组n=5，WT（scrambled gRNA）组n=12，SUV39H1-edited组n=10。图C和图D展示了CAR-T细胞在骨髓中的数量（图C为第10天，图D为第17天）。图E和图F展示了CAR-T细胞在第10天（图E，上排）和第17天（图F，下排）的IL7R-α（左图）和CD27（右图）流式细胞术图。图G总结了第10天（图F）和第17天（图G）IL7R-α和CD27流式细胞术图的重复实验数据。SUV39H1的破坏增强了CAR-T细胞的抗肿瘤效果，特别是在低剂量CAR-T细胞治疗下，显著提高了1928z CAR-T细胞的抗肿瘤效果，与未编辑的1928z CAR-T细胞相比，SUV39H1-edited 1928z CAR-T细胞（称为SUV KO 1928z）在观察期间有9/10的NALM6小鼠存活超过90天，而未编辑的1928z CAR-T细胞（称为WT 1928z）只有1/12的小鼠存活。此外，SUV39H1的破坏增强了CAR-T细胞的早期扩增，增加了IL7Rα的表达，同时减少了CD27和PD1的表达，这表明SUV39H1的破坏促进了CAR-T细胞的早期扩增和记忆T细胞亚群的标记，同时减少了与白血病相关的抑制性受体的表达。
图3展示了SUV39H1基因编辑对CAR-T细胞增殖、效应功能限制和克隆多样性维持的影响。图A描述了单细胞转录组分析的设计，CAR-T细胞在融合前（第0天）、第9天和第16天进行了单细胞RNA测序。图B展示了所有三个时间点的均匀流形近似和投影（UMAP）以及CD4和CD8的表达。图C显示了不同细胞群的标记表达。图D通过基因集富集分析（GSEA）显示了SUV39H1编辑的1928z CAR-T细胞中与增殖相关途径的富集和WT 1928z CAR-T细胞中与效应功能相关途径的富集。图E展示了第9天循环细胞的比例。图F展示了WT和SUV KO 1928z CAR-T细胞中Gini指数随时间的变化，该指数与TCR多样性呈负相关。单细胞转录组分析表明，SUV39H1的破坏在人类CAR-T细胞中促进了增殖和记忆程序，限制了效应程序，并维持了更广泛的克隆库。
图4展示了SUV39H1基因破坏对CAR-T细胞在多次CAR刺激后分泌细胞因子和颗粒酶B（GZMB）的影响。图A描述了重复CAR刺激实验的示意图，细胞因子在与靶细胞共培养24小时后在培养基质中测量。图B显示了未编辑和SUV39H1编辑的1928z CAR-T细胞的细胞因子分泌情况，其中IL2在第21天低于检测限，而TNF在第14天和第21天均低于检测限。数据显示，SUV39H1的破坏适度减弱了IL2、TNF和IFNγ的细胞因子以及GZMB的分泌。这些结果表明，SUV39H1基因的破坏在CAR-T细胞激活时适度减少了细胞因子和颗粒酶B的分泌。
图5展示了SUV39H1基因破坏对CAR-T细胞在多次CAR刺激条件下的代谢适应性的影响。图A描述了重复CAR刺激实验的示意图，其中在指定时间点测量了氧气消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。图B和图C展示了未编辑的gRNA处理的CAR T细胞和SUV39H1编辑的1928z CAR T细胞在指定时间点的OCR和ECAR率。数据显示，经过2轮CAR刺激后，未编辑和SUV39H1编辑的CAR T细胞之间没有显著差异（图B，左图）。然而，在第3轮和第4轮CAR刺激后，SUV KO 1928z CAR T细胞显示出更大的线粒体功能，这表明细胞适应性得到改善（图B，中图和右图）。另一方面，糖酵率在WT和SUV KO 1928z CAR T细胞之间没有显著差异（图C）。这些观察结果表明，SUV39H1的破坏限制了细胞因子分泌并促进了CAR T细胞的线粒体适应性。
图6展示了SUV39H1编辑的1928z CAR-T细胞在多次肿瘤再挑战中的保护作用。图A描述了再挑战研究的设计，小鼠接受了2e5 CAR T细胞/只的剂量。图B显示了肿瘤负担随时间的变化，肿瘤再挑战由箭头指示。图C比较了未编辑和SUV39H1编辑的1928z CAR-T细胞在第51天的肿瘤负担。图D和图E展示了在5轮再挑战后骨髓和脾脏中的CAR T细胞数量。图F和图G展示了第70天的CAR T细胞CD27、PD1、LAG3、TIM3流式细胞术图和CD27和抑制性受体表达的总结数据。数据显示，SUV39H1的破坏增强了CAR T细胞克服多次肿瘤再挑战的能力，并且在骨髓和脾脏中改善了CAR T细胞的数量。此外，SUV39H1编辑的1928z CAR T细胞中抑制性受体的表达减少。这些观察结果表明，SUV39H1的破坏增强了1928z CAR T细胞的功能持久性。
图7展示了SUV39H1基因破坏对CAR T细胞多功能持久性的影响。图A描述了再挑战研究的设计，小鼠接受了2e5 1928z CAR T细胞的剂量，肿瘤再挑战使用了2e6 NALM6。图B是记忆、效应和抑制受体基因的RNA测序热图。图C通过基因集富集分析（GSEA）显示了未编辑的1928z CAR T细胞中人类T细胞耗竭特征的富集。图D是平均值图（ATACseq）。图E是ATACseq热图，突出显示了与记忆、效应和抑制受体基因最相关的最显著峰。图F是基因下调的motif富集分析，识别了SUV39H1编辑的1928z CAR T细胞中下调基因中富集的TCF1/LEF1基序。图G是总结结果的图形模型。这些发现表明，经过多次肿瘤暴露后，SUV39H1编辑的1928z CAR T细胞将保持对已知促进T细胞记忆和功能的位点的可及性。SUV39H1编辑的1928z CAR T细胞也减少了效应转录因子和抑制受体的可及表达。
总的来看，这篇文章研究了SUV39H1基因破坏对CAR-T细胞功能和持久性的影响。通过CRISPR/Cas9系统对健康捐赠者分离的T细胞进行SUV39H1基因编辑，然后进行CAR转导。研究发现，SUV39H1基因破坏增强了CAR-T细胞的早期扩增、长期持久性和整体抗肿瘤效果，特别是在人类白血病和前列腺癌模型中。SUV39H1编辑的CAR-T细胞在体外和体内实验中显示出了更强的抗肿瘤效果。SUV39H1基因破坏还减少了CAR-T细胞在多次再挑战后的抑制性受体表达，限制了CAR-T细胞的耗竭。转录组和基因组可及性分析显示，SUV39H1编辑的CAR-T细胞中记忆转录因子的表达和可及性得到改善，抑制性受体的表达减少。可以看出，通过表观遗传编程CAR-T细胞，可以平衡其功能和持久性，从而改善过继性T细胞疗法的效果，这是很有前景的一种研究方向。
