自体CAR-T细胞的制造成本高昂且耗时，这大大限制了规模化和工业化。而且由于CAR-T细胞制备失败或疾病快速进展，也使得大多数患者无法从自体CAR-T19细胞中最终受益。因此，探索同种异体CAR-T细胞（一种使用多种基因编辑方法用于即时临床应用的“现成”CAR-T 细胞产品）已成为癌症免疫治疗领域的重点。CRISPR/Cas9技术已成为一种简单高效的靶细胞基因修改方法。这项研究探讨了通过CRISPR/Cas9技术编辑HLA-A/B和TRAC基因，制造出的通用型异体CAR-T19（U-CAR-T19）细胞在治疗B细胞恶性肿瘤中的潜力。
图1展示了通过CRISPR/Cas9技术编辑的通用型异体CAR-T19（U-CAR-T19）细胞的特性和抗肿瘤功能。图A描述了U-CAR-T19细胞的基因编辑策略，包括敲除TRAC和B2M基因。图B和C展示了CD19 CAR-T细胞和U-CAR-T19细胞的表型和功能，包括CD3和B2M的表达以及对CD19阳性靶细胞的细胞毒性。图D和E展示了不同效应细胞与靶细胞比例（E:T）下的细胞毒性和细胞存活率。图F比较了不同时间点（第1、2和3天）U-CAR-T19细胞与CAR-T19细胞的增殖情况。这些结果表明，尽管U-CAR-T19细胞在体外对CD19阳性靶细胞具有细胞毒性，但在体内的扩增和抗肿瘤效果不如预期，这可能是由于NK细胞的激活和杀伤导致的。nU-CAR-T19细胞在体内对NK细胞的抗性增强，有助于它们在体内的持久性和抗肿瘤效果。
图2展示了基因编辑的CAR-T19细胞在体内抗肿瘤活性和异体反应性。图A描述了Raji异种移植肿瘤模型的实验设计，其中B-NDG小鼠被静脉注射了Luc标记的Raji细胞，随后在7天后通过尾静脉注射了基因编辑的CAR-T细胞。图B显示了不同基因编辑的CAR-T19细胞处理组小鼠的荧光图像。图C展示了每组小鼠接受不同CAR-T19细胞治疗后的生物发光强度平均值。图D评估了每组小鼠的存活率，显示CAR-T细胞治疗组的小鼠存活时间延长。图E至G展示了对NOD小鼠进行的不同基因编辑CAR-T19细胞的GvHD实验，评估了小鼠的存活率、血清IFN-γ水平和体重变化。统计分析显示，基因编辑的U-CAR-T19细胞在体内具有抗肿瘤活性，并且通过敲除TRAC和B2M基因减少了异体反应性，从而提高了临床应用的安全性。
图3展示了U-CAR-T19细胞在B细胞恶性肿瘤患者体内扩增和抗肿瘤效果的缺失。图A和B显示了U-CAR-T19细胞输注后体内CAR+CD8+或CD4+细胞的百分比，图C展示了每位患者体内CAR拷贝数的变化。结果显示，在输注U-CAR-T19细胞后，患者体内未观察到细胞扩增或抗肿瘤反应。图D显示了U-CAR-T19细胞输注后体内CD19+B细胞的百分比增加，图E展示了每位B-ALL患者的微小残留疾病（MRD）情况，图F分析了U-CAR-T19细胞输注后体内NK细胞的活化情况。这些结果表明，U-CAR-T19细胞的抗白血病能力受到体内扩增缺乏的限制，这暗示了异体U-CAR-T19细胞可能被宿主免疫系统排斥。然而，通过CRISPR/Cas9技术编辑HLA-A、HLA-B和TRAC基因，同时保留其他HLA-I分子，生成了新型U-CAR-T19（nU-CAR-T19）细胞，这些细胞在体外对NK细胞具有更强的抗性，表明nU-CAR-T19细胞可能在体内具有更好的持久性和抗肿瘤效果。
图4展示了nU-CAR-T19细胞的特性和功能。图A描述了实验设计，包括从健康供体中分离异体PBMCs和T细胞，与辐射处理的供体T细胞、nU-CAR-T19和U-CAR-T19细胞共培养进行细胞毒性实验。图B显示了野生型T细胞（WT T）、U-CAR-T19和nU-CAR-T19细胞与来自同一供体的PBMCs共培养后，CFSE阳性细胞的残余比例。图C展示了nU-CAR-T19和U-CAR-T19细胞与异体PBMCs共培养后，CFSE阳性细胞的残余比例，以及在有无NK细胞存在下的情况。图D至图H展示了WT T、nU-CAR-T19和U-CAR-T19细胞在辐射处理后与CD3/CD28抗体激活的异体T细胞共培养的结果，以及与异体PBMCs共培养7天后的扩增和活化情况。图F和图G分别展示了U-CAR-T19和nU-CAR-T19细胞在与CD19表达的Raji细胞刺激后，效应细胞对靶细胞的杀伤以及细胞增殖反应。这些实验结果表明，nU-CAR-T19细胞在体外对Raji细胞显示出与U-CAR-T19细胞相当的抗肿瘤活性，并且在体内对NK细胞具有更强的抗性，这表明nU-CAR-T19细胞在进一步研究中具有优势。此外，nU-CAR-T19细胞对活化的异体T细胞具有免疫耐受性，这表明nU-CAR-T19细胞在体内可能具有更好的持久性和抗肿瘤效果。
图5展示了nU-CAR-T19细胞在治疗复发性或难治性（R/R）B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）患者中的潜在抗白血病能力。图A显示了nU-CAR-T19细胞输注后患者骨髓中微小残留疾病（MRD）的变化，所有患者在接受nU-CAR-T19细胞输注后14天达到MRD阴性。图B和图C分别展示了nU-CAR-T19细胞在体内的持续存在和扩增情况，与接受U-CAR-T19细胞治疗的患者相比，接受nU-CAR-T19细胞治疗的患者体内观察到更高的CAR拷贝数峰值。图D展示了nU-CAR-T19细胞输注后患者体内IL-6水平的动态变化，与接受U-CAR-T19细胞治疗的患者相比，接受nU-CAR-T19细胞治疗的患者体内IL-6水平更高。图E和图F显示了nU-CAR-T19细胞输注后患者体内NK细胞的活化情况，流式细胞术分析表明，与接受U-CAR-T19细胞治疗的患者相比，接受nU-CAR-T19细胞治疗的患者体内NK细胞没有显著活化或扩增。这些结果表明nU-CAR-T19细胞在体内具有有效且安全的抗白血病活性。
图6总结了一名复发性或难治性（R/R）B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）患者在接受两轮nU-CAR-T19细胞输注后的治疗效果。图A展示了治疗时间线，包括氟达拉滨（fludarabine）、环磷酰胺（cyclophosphamide）、依托泊苷（etoposide）和全身照射（TBI）的预处理，以及nU-CAR-T19细胞的输注。图B显示了nU-CAR-T19细胞输注后患者外周血中的CAR拷贝数和淋巴细胞百分比，以及骨髓中的MRD变化。图C和图D分别展示了nU-CAR-T19细胞输注后患者肝功能和细胞因子水平的动态变化。图E和图F展示了两轮nU-T19细胞输注后患者体内细胞因子释放和炎症指数的变化。这些结果表明，nU-CAR-T19细胞在患者体内表现出可管理的安全性和显著的“现成”抗白血病活性。
研究者通过基因编辑技术，开发出了一种“现成”的异体CAR-T细胞产品，并讨论了扩展临床应用的可及性。在体外和动物模型中，U-CAR-T19细胞显示出与常规CAR-T19细胞相当的抗肿瘤能力。在临床试验中，六名接受基因编辑异体U-CAR-T19细胞治疗的R/R B细胞恶性肿瘤患者未观察到U-CAR-T19细胞的扩增、抗肿瘤效果或移植物抗宿主病（GvHD）。通过改变基因编辑策略制造的新型U-CAR-T19（nU-CAR-T19）细胞在三名R/R B-ALL患者中实现了微小残留疾病阴性的缓解，表明nU-CAR-T19细胞在治疗B细胞恶性肿瘤中极具潜力，可以进一步深入研究。
