如何建立和培养来自成人干细胞的人类肠道类器官的研究

成体干细胞（ASC）衍生的肠道类器官是三维的微型肠道上皮组织，能够在体外扩增，它们保留了原始组织的特性，对于研究肠道生理学、干细胞分化动态以及人类疾病具有重要价值。与传统的细胞系相比，这些类器官提供了一个更接近体内情况的研究平台，使得科学家能够在人类组织特有的背景下，直接研究不同细胞类型之间的相互作用，以及在疾病状态下的肠道功能和病理变化。此外，肠道类器官技术的发展与成体肠道上皮发育的信号通路知识紧密相关，特别是Wnt、EGF、Notch和BMP信号通路，这些通路共同调控着肠道干细胞的自我更新和分化。因此，这项技术的进步为研究肠道生物学和疾病提供了一个强大的工具。

图1展示了从正常组织新鲜活检中建立人类结肠类器官系的过程，包括细胞培养建立（左侧）、第一次分裂前（中间）和第一次分裂后（右侧）的代表性图像，其中P表示传代次数，d表示播种或传代后的天数，比例尺为0.5毫米，直观地反映了类器官从初始培养到扩增的形态变化和生长情况。

图2详细描述了人类肠道类器官的机械分裂和扩增过程，包括培养程序的图解（A）、用于机械破坏类器官的玻璃Pasteur移液管与10μl枪头的连接（B）、机械分裂后不同天数类器官培养的代表显微图像（C），以及健康类器官与亚优类器官的对比，前者主要由干细胞和增殖细胞组成，后者显示出分化迹象，如壁厚增加（D）。这些图像和图解共同展示了类器官培养的关键步骤和健康状态评估，为理解和优化类器官的扩增提供了视觉参考。

图3展示了人类肠道类器官分化为不同肠道上皮细胞系的过程，其中图A展示了按照Beumer等人（2020）的方法向肠内分泌细胞系分化的类器官的代表性图像，图B展示了向肠上皮细胞系分化的类器官的代表性图像，包括一个放大的内嵌图显示分化类器官中的肠上皮细胞（箭头所示），比例尺分别为0.2毫米和0.4毫米，这些图像直观地展示了类器官在特定分化条件下的形态变化，为研究人类肠道上皮功能提供了重要的视觉证据。

图4展示了在扩增条件下培养的人类肠道类器官的免疫荧光成像结果，图像中显示了DAPI染色的细胞核（蓝色）、KI67增殖标记（绿色）以及用Phalloidin-Atto 647N染色的F-actin（红色），这些标记共同揭示了类器官的细胞增殖和结构特征，比例尺为0.1毫米。这些荧光图像提供了对类器官细胞组成和增殖状态的深入理解，强调了免疫荧光技术在研究肠道类器官生物学中的重要性。

图5概述了从单细胞克隆培养人类肠道类器官的过程，包括图解说明（A）、用于细胞分选的流式细胞术门控策略（B）、10天后单细胞类器官生长的图像（C）以及从挑选的单个类器官中获得的类器官片段（D）。这些图像和图解展示了从单个活细胞的筛选、培养到形成成熟类器官的完整流程，突出了克隆培养技术在类器官研究中的关键作用，尤其是在进行基因编辑和全基因组测序等应用时。

该研究提供了一套详细的实验方案，用于从成体干细胞建立和培养人类肠道类器官，包括从新鲜肠道活检样本中培养类器官的基本指南、类器官的机械分裂和扩增、类器官的冷冻保存和复苏、免疫荧光染色以及单细胞克隆类器官培养等关键技术。这些成果不仅推动了对肠道生理学和疾病条件的深入理解，而且为未来的再生医学方法提供了技术基础，特别是在疾病建模、遗传工程修复以及癌症研究和治疗响应分析等方面展现了巨大的应用潜力。

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