今天和大家分享的文献是2024年11月4日刚刚发表在《scientific reports》的文章《Automated and closed clinical-grade manufacturing protocol produces potent NK cells against neuroblastoma cells and AML blasts》。
作者团队的研究关注NK细胞的同种异体免疫疗法，在文章中，主要描述了为高风险急性髓性白血病（AML）和神经母细胞瘤（NBL）患者量身定制的、功能性强大的NK细胞的符合GMP的生产方案的开发。除此之外，文章还分享了早期临床开发中产品批次规格的质量控制策略和考虑因素。
一、生产流程
上图展示了在CliniMACS Prodigy平台上进行的自动化三步法生产激活的NK细胞产品的工作流程。该流程包括以下步骤：
第一天的流程：
白细胞分离术（Leukapheresis）：从健康捐赠者体内分离出富含白细胞的血浆。
样本采集（Sample）：采集初始样本进行质量控制测试，包括供体筛查、外观、体积和无菌测试。
CD3耗竭（CD3 depletion）：使用CliniMACS Prodigy系统和特定的试剂，去除T细胞，留下NK细胞。
CD56富集（CD56 enrichment）：进一步富集NK细胞，提高其纯度。
激活（Activation）：在NK MACS培养基中，加入5%人类AB血清、500 IU/mL IL-2和140 IU/mL IL-15，激活NK细胞12小时。
第二天的流程：
最终产品配制（End product formulation）：将激活的NK细胞与注射缓冲液混合，准备用于患者输注。
TCB（目标细胞袋）：包含最终的NK细胞产品，准备进行质量控制和最终释放。
终产品质量控制（QC）：对最终产品进行视觉检查、细胞计数和活力测试，以及身份和纯度测试，确保产品符合临床标准。
在整个制造过程中，包括在白细胞分离术、CD3耗竭、CD56富集和最终产品配方阶段，都有严格的质量控制（QC）措施，确保产品的一致性和纯度。包括使用细胞计数、细胞活力、无菌测试、内毒素测试、支原体测试等。也会对NK细胞的表型和激活标记物进行特征分析，以及评估其细胞毒性。
整个流程在A级隔离器中进行，以保持最高的无菌标准。图中还标注了用于临床研究的产品的无菌测试和质量控制分析点，这些分析对于产品进入临床研究至关重要。整个流程旨在为临床I/II期试验生产出符合GMP标准的激活NK细胞产品。
二、质量和功能评估
除了生产流程，作者还展示了对他们生产的NK细胞的质量和功能评估结果。总的来说，大体包括以下几个方面：
细胞纯度和安全性：生产的NK细胞产品显示出高纯度，CD3-CD56+细胞平均达到98.4%，残留的T细胞比例平均仅为0.01%，表明产品具有很高的安全性。
细胞表型稳定性：通过流式细胞术对NK细胞的表型标记进行分析，包括CD16、CD57、NKG2A、NKG2D、LAG3和NKG2C，结果表明在整个制造过程中NK细胞的表型始终保持稳定。
细胞毒性功能：激活的NK细胞在体外对K562和SH-SY5Y靶细胞的杀伤效力显著增强，即使在冷冻/解冻周期后，这些激活的NK细胞仍保持了一定的功能。对来自AML患者的前体细胞也显示出显著增强的杀伤效力，支持了它们在AML治疗中的潜在应用。
脱颗粒反应：通过测量CD107a的表达来评估NK细胞的脱颗粒反应，发现与K562细胞共培养的NK细胞中CD107a的表达更高，表明对白血病细胞的杀伤活性更强。
质量和功能评估的结果表明，生产的NK细胞产品在纯度、安全性、功能性和毒性方面均达到了高标准，为AML和NBL患者的临床应用提供了有力支持。
三、细胞计数为何如此重要？
在本篇文章的生产流程中，多次提到细胞计数，这是因为细胞计数（cell count）是质量控制（QC）的一个关键部分，它的重要性体现在以下几个方面：
确定NK细胞的产量和纯度：细胞计数有助于确定从制造过程中得到的NK细胞的总量，以及这些细胞中NK细胞的纯度。这对于评估生产过程的效率和最终产品的质量至关重要。
评估激活效果：通过比较激活前后的细胞计数，可以评估细胞因子激活对NK细胞数量的影响，从而了解激活过程是否有效。
确保治疗剂量：细胞计数对于确定患者所需的治疗剂量至关重要。在细胞治疗中，通常需要达到一定的细胞数量才能确保治疗效果。
安全性和有效性：准确的细胞计数有助于确保最终产品符合安全性和有效性的标准，这对于患者治疗的成功和避免不良反应至关重要。
标准化生产：在临床开发早期阶段，细胞计数是标准化生产过程的关键，确保每批产品都能达到一致的质量标准。
监管合规性：在GMP（良好生产规范）环境下，细胞计数是满足监管要求和进行产品放行前必须进行的测试之一。
后续研究和优化：细胞计数数据为后续的生产优化和研究提供了基础，帮助研究人员理解不同生产步骤对细胞数量和质量的影响。
总之，细胞计数是确保NK细胞产品在质量和数量上符合预期标准的关键质量控制步骤，对于生产出安全有效的细胞治疗产品至关重要。
本文中介绍的生产流程所用的细胞计数仪是Nucleocounter NC-100 (ChemoMetec)，厂家Chemometec（https://www.chemometec.com/）是全球领先的细胞计数和分析设备制造商。专注于开发和生产高精度仪器，为生物技术、制药和学术领域的数千家客户提供一致的数据。在丹麦设计、制造和测试。自1997年以来，一直使用优质材料和专业的工艺制造仪器和耗材。旗下拥有NucleoCounterNC100/200/202/250/3000等机型的计数仪产品。
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