嵌合抗原受体（CARs）被设计用于重定向免疫细胞，如T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和巨噬细胞，以靶向并消除表达特定配体的细胞。CAR-T细胞在癌症免疫治疗中表现出显著的成功，而CAR-NK细胞则因其直接破坏肿瘤细胞的能力而具有潜力。目前，CAR设计主要集中在CAR-T细胞上，通过开发不同的细胞内域，如不同的CDs和信号域（SDs），以提高其抗肿瘤效果。NK细胞在装备CARs时面临维持增殖、持久性的挑战。细胞内域中免疫受体-酪氨酸基激活基序（ITAMs）的数量决定了CAR-T细胞的激活程度。本研究比较了七种不同的CAR设计在CD19 CAR-NK细胞中的效果，发现CD8 TMD-CD3ζ SD配置展现出最强的抗肿瘤活性，而减少ITAMs的数量对CAR-NK细胞的治疗效力影响不大。所有CAR-NK细胞在与靶标持续接触后，耗竭标志物的表达增加，提示结合免疫检查点抑制剂可能提高治疗效果。这些发现为CAR-NK细胞产品的临床应用设计提供了重要见解。
图1展示了通过使用七种不同的CAR构建体（CAR1-CAR7）来增强CD19 CAR-NK细胞的效能的过程。这些构建体在TMDs（跨膜域）、CDs（共刺激域）和SDs（信号域）上有所不同，允许全面比较这些组分如何影响NK细胞中CAR的功能。每个构建体都使用抗CD19单链可变片段FMC63靶向B细胞抗原CD19，并将其与CD8α铰链和CD8或CD28的TMD相连，然后是一个SD（CD3ζ、CD3ζ-1 ITAM或FcεRIγ），单独使用或与4-1BB或OX40 CD结合。这些CAR元素被整合到基于小鼠白血病病毒的SFG慢病毒载体中，而对照载体则包含EGFP编码序列而非CAR组分。通过转染293T细胞来生成慢病毒颗粒，并通过Amicon Ultra-15离心过滤器浓缩病毒上清液，使用HeLa细胞确定病毒滴度。为了模拟可扩展的“现成”CAR-NK细胞用于过继免疫疗法，研究中使用了冷冻保存的CAR-NK细胞进行功能分析。具体来说，通过旋转感染将慢病毒（MOI=5）转导到激活的、去除T细胞（CD3-）的脐带血来源的NK（UCB-NK）细胞中（每组1亿个细胞），以制备CD19 CAR-NK细胞。通过流式细胞术评估了慢病毒感染后2天CD19 CAR的表达，发现不同病毒组的感染率相似，为30%-35%。随后，使用K562-mIL-21饲养细胞将CAR-NK细胞扩增6天，然后计数并液氮冷冻保存以进行进一步的功能分析。在三天独立实验中，使用不同UCB供体的CAR-NK细胞平均扩增了14到23倍。值得注意的是，CAR6-NK细胞扩增至约7.5亿，而CAR4-NK细胞至少达到约4.4亿。尽管如此，其他五种构建体的CAR-NK细胞总数与扩增的CAR6-NK细胞相当。总的来说，研究成功设计并转导了七种抗CD19 CAR构建体到NK细胞中，并观察到在K562-mIL-21细胞存在下的不同扩增效率。
图2中的内容展示了七种不同的抗CD19 CAR构建体在NK细胞中的表达和抗肿瘤活性。图(A)和(B)分别显示了对照组(Ctrl-NK)和各种CAR-NK细胞在解冻后的EGFP或CAR表达情况，以及经过24小时培养后的细胞分选纯度分析。图(C)展示了Mock-NK、Ctrl-NK和CAR-NK细胞对B-ALL细胞系Nalm-6的细胞毒性分析，其中CAR-NK细胞表现出显著的细胞毒性。图(D)至(G)进一步分析了在特定的效靶比(E:T)下，即0.2:1、0.4:1、0.8:1和1.6:1时，CAR-NK细胞的特异性细胞毒性。结果表明，CAR1-NK细胞在低E:T比率下具有最佳的抗肿瘤活性，尤其是在0.2:1、0.4:1和0.8:1的E:T比率下，其细胞毒性显著高于其他六种CAR-NK细胞。在1.6:1的E:T比率下，CAR1-NK细胞仍然保持优越的抗肿瘤活性，并且与CAR2-、CAR3-和CAR4-NK细胞的性能相似，而CAR5-、CAR6-和CAR7-NK细胞的细胞毒性则相对较低。这些发现表明，CAR1-NK细胞在较低的E:T比率下优于其他六种CAR-NK细胞，而在较高的E:T比率下，CAR1-NK细胞以及CAR2-、CAR3-和CAR4-NK细胞显示出相似的细胞毒性，但CAR5-、CAR6-和CAR7-NK细胞的细胞毒性则较弱。
图3中的内容展示了七种CD19 CAR-NK细胞的分子特性分析。图(A)显示了CAR-NK细胞在与Nalm-6细胞共培养4小时后CD107a的表达水平，与Mock-NK和Ctrl-NK细胞相比，所有CAR-NK细胞的CD107a表达水平均有所提高，其中CAR1-NK细胞的表达水平最高，与其优越的体外细胞毒性相一致。图(B)和(C)分别评估了IFN-γ和TNF-α的产生，所有CAR-NK细胞在Nalm-6细胞刺激下均能产生这两种细胞因子，但其表达水平与CAR-NK细胞的体外细胞毒性无明显相关性。图(D)和(E)分别展示了凋亡相关配体（TRAIL和FasL）、典型NK细胞受体（包括激活性受体和抑制性受体）以及效应分子（GzmB和Perforin）的表达分析。所有CAR-NK细胞都高度表达了这些典型的NK细胞表面受体和细胞毒性颗粒，表明这些CAR构建体在NK细胞中具有典型的NK细胞特征。特别是CD107a的表达水平突出了CAR构建设计在NK细胞中的有效性。
图4中的内容展示了七种CD19 CAR-NK细胞在体外连续杀伤实验中的持久细胞毒性和分子特征。图(A)和(B)显示了在三轮连续的Nalm-6细胞杀伤实验中，CAR-NK细胞的细胞毒性分析，与Mock-NK或Ctrl-NK细胞相比，所有类型的CAR-NK细胞都表现出强大的细胞毒性，这种连续杀伤的能力在Mock-NK或Ctrl-NK细胞中并未观察到。图(C)和(D)通过流式细胞术分析了在两轮杀伤前后，CAR-NK细胞的激活效应分子（2B4、DNAM-1和NKp46）和耗竭标志物（TIGIT、TIM-3和PD-1）的表达。结果显示，尽管在重复接触Nalm-6细胞后，耗竭标志物的表达普遍增加，但所有CAR-NK细胞组都保持了类似的激活和耗竭受体的表达水平。特别是CAR2-NK和CAR4-NK细胞显示出较低的耗竭受体PD-1的表达水平，而CAR7-NK细胞显示出最高水平，这表明FcεRIγ信号域可能减轻了CAR-NK细胞的耗竭，而CAR7构建体可能在靶向肿瘤杀伤过程中诱导NK细胞更大的耗竭。
图5展示了七种CD19 CAR-NK细胞在体内治疗B-ALL异种移植模型的潜力。通过在NCG免疫缺陷小鼠中建立的模型，研究发现所有七种CD19 CAR-NK细胞与Mock-NK细胞相比，都能显著降低肿瘤负担并延长小鼠生存期。特别是CAR1-NK和CAR3-NK细胞在肿瘤清除效果上优于CAR5-、CAR6-和CAR7-NK细胞。生物发光成像（BLI）用于监测肿瘤进展，结果显示CAR-NK细胞治疗组在治疗后21天内肿瘤负担显著降低，生存曲线表明CAR1-、CAR2-、CAR3-和CAR4-NK细胞治疗的小鼠生存期更长，这些结果与体外细胞毒性实验结果相一致。
图6中的内容展示了在肿瘤携带小鼠中，七种CD19 CAR-NK细胞输注后的动力学和持久性。图(A)通过流式细胞术分析了第7天外周血（PB）中人CD45+CD56+CD19 CAR+细胞的存在情况，结果表明在所有治疗组中均能检测到这些细胞。到了第14天，人CD45+细胞在外周血中的水平显著下降。图(B)至(D)进一步分析了第7天和第14天外周血中hCD45+细胞群体、hCD45+CD56+ NK细胞群体以及hCD45+CD56+CD19 CAR+细胞群体的比例。结果显示，CAR3-NK细胞治疗组的小鼠在外周血中显示出最高的CAR-NK细胞百分比，而CAR5-NK细胞治疗组则显示出最低水平，这与CAR3-NK和CAR5-NK细胞的肿瘤杀伤效果相对应。这些研究结果表明，所有七种CD19 CAR-NK细胞都能介导增强的抗肿瘤活性，特别是当CAR构建体包含CD8 TMD和CD3ζ SD或与OX40 CD结合时。
本研究通过设计七种不同的CD19 CAR构建体并将其转导至自然杀伤（NK）细胞，系统评估了这些CAR-NK细胞在体外和体内对B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）细胞系Nalm-6的抗肿瘤活性。研究发现，所有CAR-NK细胞在体外均表现出显著的细胞毒性，其中CAR1-NK细胞在低效靶比下显示出最佳的抗肿瘤活性。在体内，CAR-NK细胞治疗显著延长了肿瘤携带小鼠的生存期，并且CAR1-、CAR2-、CAR3-和CAR4-NK细胞在肿瘤清除方面表现更为优越。此外，CAR-NK细胞在小鼠体内的动力学和持久性分析显示，CAR3-NK细胞在外周血中的持久性最高，与CAR5-NK细胞相比，其肿瘤杀伤效果更强。这些结果为CAR-NK细胞产品的临床应用开发提供了重要参考，特别是对于CAR构建体的设计方面，为增强NK细胞的抗肿瘤效果研究提供了有意义的见解。
