三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌最复杂和最具挑战性的亚型，其特征是缺乏三个关键受体：雌激素受体、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）。TNBC对传统疗法，如手术切除、放疗和新辅助化疗等构成了挑战。这些治疗往往无法完全根除肿瘤，导致全身复发和转移，并且常常导致预后恶劣和生存率降低。因此，在治疗TNBC，特别是在非免疫富集亚型的情况下，迫切需要创新和更有效的治疗策略。
目前，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法作为一种免疫疗法，为治疗TNBC提供了一个有前景的途径。在TNBC中已经验证了多种潜在的肿瘤相关抗原（TAA），如间皮素、叶酸受体α、肿瘤内皮标记8、NKG2D配体、表皮生长因子受体（EGFR）和CD276分子（B7-H3），这些都能对TNBC肿瘤发挥CAR-T的抗肿瘤效果。但CAR-T细胞疗法对实体肿瘤的疗效有限，这主要归因于肿瘤诱导的免疫抑制。CAR-T细胞疗法的有效性可以通过使用使肿瘤细胞更容易受到T细胞攻击的药物（例如细胞因子和抑制剂）来提高，需要开拓额外的策略来增强CAR-T细胞对实体肿瘤的疗效。
诱导型共刺激因子配体（ICOSL）在实体肿瘤细胞中高度表达，如黑色素瘤和横纹肌肉瘤，并且与不良预后相关。诱导型T细胞共刺激因子（ICOS），属于CD28家族，在T细胞激活时上调。通过与其配体ICOSL的相互作用，ICOS在塑造随后的T细胞分化和促进其生存方面发挥关键作用，这一功能与CD28不同。这种相互作用刺激T细胞产生一系列细胞因子，如白细胞介素（IL）-10、IL-4、IL-5、干扰素-γ（IFN-γ）和IL-17，其主要作用因所涉及的特定细胞类型而异。越来越多的证据强调了ICOS/ICOSL在塑造各种癌症，包括黑色素瘤、结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌中的肿瘤免疫环境中的作用。然而，ICOS/ICOSL对癌症的影响各不相同，这取决于所涉及的主要细胞类型。例如，在结直肠癌中，ICOS的表达与预后呈正相关，类似于Th1和细胞毒性T细胞的特征。相反，在卵巢癌和乳腺癌中，肿瘤浸润的ICOS+调节性T细胞（Tregs）作为负面预后因素，因为它们与ICOSL+浆细胞样树突细胞（pDCs）结合，通过IL-10的分泌促进肿瘤抑制环境。因此，进一步研究以评估ICOS/ICOSL在癌症治疗中的临床应用是有必要的。
一些研究表明ICOS可以增强CAR-T免疫疗法。在研究中，作者团队观察到TNBC肿瘤组织中ICOSL的高表达，这与TNBC患者的不良预后生存相关。因此，研究开发了包含全长ICOS的ICOS-B7H3-CAR-T细胞，其特点是ICOS表达增强并靶向B7H3。这种修改通过使CAR-T细胞能够与肿瘤细胞上的ICOSL结合，提高了CAR-T细胞的疗效，增强了CAR-T细胞的增殖和持久性。与B7H3-CAR-T细胞相比，ICOS-B7H3-CAR-T细胞在体外和体内对TNBC细胞表现出更高的抗肿瘤活性。此外，ICOS-B7H3-CAR-T细胞增加了如干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）等细胞因子的分泌。而且，体内实验显示ICOS-B7H3-CAR-T细胞显示出持久的抗肿瘤活性，并且能够有效地消除TNBC转移模型中的转移。作者团队的发现表明，TNBC细胞上ICOSL的表达增强了ICOS-B7H3-CAR-T细胞的优越效果。靶向表达ICOS的CAR-T细胞可能代表了对抗TNBC复发和转移的一种有前途的策略。
图1展示了ICOSL在三阴性乳腺癌（TNBC）中的高表达与患者不良预后的关联。图(A)通过GEPIA在线服务分析了乳腺癌中ICOSL的表达，发现基底样乳腺癌中ICOSL表达显著高于HER2阳性和腔面样阳性乳腺癌。图(B)的Kaplan-Meier生存分析显示，基底样乳腺癌患者中ICOSL高表达与总体生存率（OS）和远处转移无病生存率（DMFS）较短相关。图(C)通过免疫组化（IHC）分析显示了TNBC和邻近非癌组织中ICOSL表达的代表性图像，并进行了定量分析。图(D)利用流式细胞术评估了正常乳腺细胞系和TNBC细胞系中ICOSL蛋白水平的频率，发现TNBC细胞中ICOSL表达水平显著高于正常乳腺细胞系MCF10A。这些结果表明，ICOSL的高表达可能作为TNBC治疗的潜在靶点，对患者的预后有重要影响。
图2内容概述了ICOS-B7H3-CAR-T细胞的生成及其在免疫治疗中的应用。图(A)展示了针对人B7H3的单链可变片段(scFv)与第三代CAR结构融合的示意图，以及ICOS-B7H3-CAR包含ICOS过表达的设计。图(B)和图(D)通过流式细胞术分析了不同组别中CAR蛋白和ICOS蛋白在T细胞上的表达频率，结果显示CAR-T细胞的慢病毒转导效率超过40%，ICOS-B7H3-CAR-T细胞的ICOS表达水平为51.6%，高于对照T细胞。图(C)通过西方印迹分析进一步证实了CAR-T细胞的高效表达。图(E)至(F)通过与MDA-MB-231-Luc和MDA-MB-468-Luc细胞共培养24小时后的荧光素酶报告系统评估了B7H3-CAR和ICOS-B7H3-CAR的细胞毒性活性，发现ICOS-B7H3-CAR-T细胞具有更高的细胞毒性，超过60%。图(G)至(J)通过ELISA测量了与肿瘤细胞共培养24小时后CAR-T细胞上清中的效应细胞因子（TNF-α和IFN-γ）水平，结果显示ICOS-B7H3-CAR-T细胞相比B7H3-CAR-T细胞增加了这些细胞因子的分泌。综合这些数据表明，表达ICOS的CAR-T细胞通过分泌TNF-α和IFN-γ在更大程度上增强了对TNBC细胞的细胞毒性。
图3展示了ICOS-B7H3-CAR-T细胞在体内展示出的优越抗肿瘤活性。图(A)是在NSG小鼠中皮下植入MDA-MB-231肿瘤细胞后，通过尾静脉注射不同CAR-T细胞的异种移植肿瘤模型示意图。图(B)显示了接受不同CAR-T治疗后携带肿瘤的小鼠的代表性图像。图(C)和(D)评估了接受不同CAR-T治疗后小鼠肿瘤的体积和重量，结果显示ICOS-B7H3-CAR-T细胞治疗显著减少了肿瘤体积和重量。图(E)通过H&E染色展示了CAR-T细胞治疗后小鼠肿瘤的组织学变化，其中ICOS-B7H3-CAR-T治疗组显示出更明显的坏死。图(F)基于CD8的免疫染色评估了不同治疗后小鼠肿瘤中浸润的CAR-T细胞的百分比，发现ICOS-B7H3-CAR-T细胞在肿瘤组织中的浸润显著增强。此外，图(G)和(H)通过ELISA测量了小鼠血清中效应细胞因子（TNF-α和IFN-γ）的水平，ICOS-B7H3-CAR-T细胞治疗显著增加了这些细胞因子的水平。对CAR-T细胞治疗的安全性进行了评估，包括监测小鼠体重和主要器官功能，结果表明在治疗过程中小鼠体重和主要器官功能保持正常，证明了修改后的CAR-T细胞的安全性。这些结果表明ICOS增强了B7H3-CAR-T细胞的抗肿瘤活性，提示其作为增强CAR-T细胞疗法细胞毒性的潜在标记物的潜力。
图4内容概述了ICOS-B7H3-CAR-T细胞在体内对三阴性乳腺癌（TNBC）转移的持久抗肿瘤活性及其根除转移的能力。图(A)展示了通过尾静脉注射Luc标记的MDA-MB-231细胞建立转移性异种移植模型的示意图，并在两周后通过尾静脉注射不同CAR-T细胞进行治疗。图(B)的Kaplan-Meier生存分析显示，与B7H3-CAR-T细胞治疗相比，ICOS-B7H3-CAR-T细胞治疗显著延长了小鼠的总体生存期。图(C)至(D)的代表性生物发光成像（BLI）图像和BLI动力学图显示，ICOS-B7H3-CAR-T细胞有效消除了TNBC的转移且无肿瘤复发，而B7H3-CAR-T细胞未能消除TNBC转移，且肿瘤负担加重。在人道终点时，通过生物发光成像评估了转移病灶，ICOS-B7H3-CAR-T细胞治疗组在消除TNBC转移方面效果最佳。图(F)展示了不同治疗后转移性异种移植模型中肿瘤浸润的CAR-T细胞百分比，ICOS-B7H3-CAR-T细胞的浸润显著增强。此外，图(G)显示ICOS-B7H3-CAR-T细胞治疗显著增加了小鼠血清中的效应细胞因子水平，包括TNF-α和IFN-γ。这些数据表明，ICOS增强了CAR-T细胞在体内的细胞毒性，并有助于持久地根除转移性肿瘤。
图5内容概述了ICOSL（可诱导型共刺激因子配体）在三阴性乳腺癌（TNBC）细胞中的高表达如何增强ICOS-B7H3-CAR-T细胞的细胞毒性功能，以及敲除ICOSL表达如何降低这种细胞毒性。图(A)至(B)通过荧光素酶报告系统评估了B7H3-CAR和ICOS-B7H3-CAR在与不同TNBC细胞共培养24小时后的细胞毒性活性，发现ICOS-B7H3-CAR-T细胞的细胞毒性活性显著增强。图(C)至(F)以及图(H)至(I)通过ELISA测量了与肿瘤细胞共培养24小时后CAR-T细胞上清中的效应细胞因子（TNF-α和IFN-γ）水平，结果显示ICOS-B7H3-CAR-T细胞在与ICOSL过表达的肿瘤细胞共培养时，这些效应细胞因子的分泌增加，而ICOSL的表达并不影响B7H3-CAR-T细胞中的TNF-α和IFN-γ水平，这表明肿瘤细胞上ICOSL的高表达对于ICOS-B7H3-CAR-T细胞的细胞毒性至关重要。此外，图(G)至(I)展示了通过sgRNA引导的CRISPR-Cas9技术敲除MDA-MB-231细胞内源性ICOSL表达后，ICOS-B7H3-CAR-T细胞的细胞毒性和TNF-α及IFN-γ的分泌水平降低至与B7H3-CAR-T细胞相当的水平。这些结果表明，肿瘤细胞上ICOSL的表达水平对于ICOS-B7H3-CAR-T细胞的优越抗肿瘤效果至关重要。
图6内容概述了ICOS-B7H3-CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养时的增殖能力。图(A)至(C)通过流式细胞术测量了Ki-67的强度，这是CAR-T细胞增殖的指标，结果显示与对照T细胞相比，B7H3-CAR-T细胞的增殖显著更高，而ICOS-B7H3-CAR-T细胞表现出更强的增殖能力。图(D)至(F)通过定量分析评估了CAR-T细胞的增殖，进一步证实了ICOS-B7H3-CAR-T细胞的增殖效率显著高于B7H3-CAR-T细胞。此外，ICOSL在肿瘤细胞上的表达显著增强了ICOS-B7H3-CAR-T细胞的增殖。相反，敲除MDA-MB-231细胞中ICOSL的表达，将ICOS-B7H3-CAR-T细胞的增殖恢复到B7H3-CAR-T细胞的水平。这些数据表明，肿瘤细胞上ICOSL的水平增强了ICOS-B7H3-CAR-T细胞的细胞毒性能力、增殖效率以及TNF-α和IFN-γ的分泌能力。
图7内容概括了ICOS-B7H3-CAR-T细胞针对表达B7H3和ICOSL的三阴性乳腺癌（TNBC）细胞的作用机制。研究结果表明，通过工程设计表达ICOS的CD8+ CAR-T细胞，能够增强其对B7H3抗原的抗肿瘤效果。特别是当与高表达ICOSL的乳腺癌细胞共培养时，这种效果更为显著。与标准的B7H3-CAR-T细胞相比，ICOS-B7H3-CAR-T细胞在体内外都显示出持续的抗肿瘤活性，有效根除转移瘤，并伴随着IFN-γ和TNF-α等细胞因子的增加分泌。值得注意的是，通过过表达或敲除TNBC细胞上的ICOSL，对ICOS-B7H3-CAR-T细胞的功能产生了深远影响，强调了ICOSL在TNBC细胞上表达对于ICOS-B7H3-CAR-T细胞发挥优越抗肿瘤效果的关键作用。
本研究成功开发了一种新型的ICOS-B7H3-CAR-T细胞疗法，用于治疗三阴性乳腺癌（TNBC）。通过在CD8+ T细胞中增强ICOS的表达，并靶向B7H3抗原，这些CAR-T细胞在体外和体内实验中均展现出了显著的抗肿瘤效果，特别是在消除转移瘤方面。研究还发现，肿瘤细胞上ICOSL的表达水平对ICOS-B7H3-CAR-T细胞的功能有显著影响，高ICOSL表达可增强这些CAR-T细胞的细胞毒性和增殖效率，以及它们分泌TNF-α和IFN-γ等效应细胞因子的能力。这些发现表明，通过调节ICOSL的表达，可以优化CAR-T细胞疗法，为TNBC患者提供了一种有前景的治疗策略。
