黑色素瘤是一种由黑色素细胞异常增殖引起的癌症，其治疗在传统免疫检查点阻断疗法无效或产生耐药性的情况下，迫切需要新的治疗方法，CAR-T细胞疗法正在被积极运用到治疗黑色素瘤的研究当中。
酪氨酸相关蛋白1（TYRP1）是一种跨膜糖蛋白，在黑色素合成中发挥重要作用。TYRP1是正常和恶性黑色素细胞中最丰富的糖蛋白之一，其在正常组织中的表达仅限于皮肤和视网膜色素上皮（RPE）。TYRP1主要位于黑色素体的细胞内，使用单克隆抗体靶向TYRP1的方案已在临床前模型和临床试验中显示出疗效。CAR将单克隆抗体的抗原特异性与T细胞效应功能结合起来，使T细胞在抗原检测后立即激活。与单克隆抗体相比，CAR-T细胞对肿瘤的生物学分布有所改善，可以在体内扩增和长期持续存在，这也避免了重复给药带来的困扰。作者团队开发了一种高灵敏度的CAR-T细胞疗法，可检测TYRP1高表达肿瘤细胞中的表面TYRP1，并探讨了其在小鼠和患者来源的皮肤、肢端和葡萄膜黑色素瘤模型中的体外体内抗肿瘤活性。
图1展示了TYRP1作为CAR-T细胞疗法靶点在黑色素瘤治疗中的相关性。通过分析723个黑色素瘤样本的转录组数据，发现约70%的黑色素瘤表达TYRP1，其中约30%呈现高水平过表达。免疫检查点阻断（ICB）治疗前后TYRP1表达未显著变化，表明TYRP1可能是一个稳定的治疗靶点。此外，肢端、粘膜和葡萄膜黑色素瘤患者中分别有59%、60%和92%呈现TYRP1高表达，这些患者可能从针对TYRP1的T细胞疗法中显著受益。免疫组化和流式细胞术分析进一步证实了TYRP1在黑色素瘤细胞表面和内部的表达，以及其在细胞表面的循环性质。这些结果强调了TYRP1作为黑色素瘤治疗靶点的临床相关性，并证明了通过CAR-T细胞疗法靶向TYRP1表面表达的可行性。
图2展示了针对TYRP1高表达和中等表达水平的黑色素瘤细胞系，优化的TYRP1 CAR-T细胞疗法的细胞毒性和细胞因子释放效果。使用20D7S单链可变区（scFv）构建的第二代CARs，包含CD28跨膜域和CD28共刺激分子及CD3ζ T细胞共受体的信号域，并通过改变连接抗原结合域和跨膜域的铰链长度来优化与抗原的相互作用。实验结果表明，所有构建的CAR-T细胞在与高TYRP1表达的黑色素瘤细胞共培养时，均能杀伤目标细胞并释放干扰素-γ（IFNγ），而与中等TYRP1表达的细胞共培养时则不会。此外，与B16小鼠黑色素瘤细胞系共培养时，三种基于20D7S的TYRP1 CARs均表现出细胞毒性并分泌细胞因子。这些结果支持了TYRP1 CAR-T细胞疗法针对TYRP1高表达的黑色素瘤的选择性和有效性。
图3展示了在TYRP1高表达的同系和患者来源的黑色素瘤模型中，具有长柔性铰链的20D7SL-28ζ CAR-T细胞疗法显示出优越的肿瘤控制能力。在体内实验中，20D7S衍生的CAR-T细胞被用于评估其对免疫能力正常的C57BL/6小鼠携带的B16黑色素瘤的抗肿瘤活性。实验中，小鼠在T细胞给药前接受了全身照射以促进T细胞的植入，并且连续三天给予三次白介素-2（IL-2）以增强CAR-T细胞的增殖。实验结果显示，尽管三种CAR构建在体外显示出相似的活性，但只有表达最长铰链的20D7SL-28ζ CAR的T细胞能够控制肿瘤生长并提高小鼠存活率。实验还评估了不同剂量的20D7SL-28ζ CAR-T细胞对整体抗肿瘤活性的影响，发现在肿瘤生长控制和存活率方面没有显著差异。值得注意的是，20D7SL CAR-T细胞即使在没有IL-2补充的情况下也能有效地控制肿瘤生长，这表明即使在对PD-1阻断没有反应的肿瘤中，过继T细胞疗法也可能成功，只要目标抗原表达水平足够且CAR构建经过优化以最大化抗原检测。除此之外，还研究了20D7SL-28ζ CAR-T细胞在患者来源的皮肤黑色素瘤模型中的抗肿瘤活性，发现这些CAR-T细胞能够控制肿瘤生长并诱导肿瘤退化。通过量化肿瘤中的T细胞浸润，证实了20D7SL治疗的肿瘤中CAR-T细胞的扩增。
图4中展示了在TYRP1高表达的黑色素瘤模型中，使用CD28作为共刺激信号的20D7SL CAR-T细胞疗法相比于使用4-1BBB的疗法具有更广泛的抗肿瘤活性。在体外实验中，20D7SL-28ζ和20D7SL-Bζ CAR-T细胞对高TYRP1表达的黑色素瘤细胞系表现出相似的细胞毒性和细胞因子分泌。在体内实验中，20D7SL-28ζ CAR-T细胞对M249和M230肿瘤模型显示出抗肿瘤活性，尤其在M249模型中控制效果更明显。相比之下，20D7SL-Bζ CAR-T细胞对M249肿瘤效果较弱，但能清除M230肿瘤。这表明，CD28信号域的CAR-T细胞疗法在多种TYRP1高表达的黑色素瘤模型中具有更强的抗肿瘤活性，这可能与抗原密度有关，其中4-1BBB信号域的CAR对抗原密度较低的肿瘤活性下降。
图5展示了20D7SL-28ζ和20D7SL-BBζ CAR-T细胞对TYRP1的特异性识别。通过敲除三种TYRP1高表达的黑色素瘤细胞系（M207、M249和M285）中的TYRP1蛋白，并测量了与亲本TYRP1高细胞系或其TYRP1敲除对应物共培养后20D7SL-28ζ和20D7SL-BBζ CAR-T细胞的细胞毒性和细胞因子释放。结果显示，共培养96小时后，TYRP1 CAR-T细胞完全抑制了三种亲本肿瘤细胞系的生长，但在TYRP1敲除细胞系中这种活性消失。此外，20D7SL-28ζ和20D7SL-BBζ CAR-T细胞与亲本细胞系共培养时分泌IFNγ，但与TYRP1敲除细胞系共培养时这种活性消失。共培养48小时后的细胞毒性剂量反应证实了TYRP1 CAR对TYRP1敲除细胞系的细胞毒性丧失。为了进一步确认TYRP1 CAR的选择性，评估了与非黑色素瘤TYRP1阴性细胞系（包括A549肺癌和UPS03和UPS04未分化多形性肉瘤）共培养后的细胞毒性和细胞因子释放。20D7SL-28ζ和20D7SL-BBζ CAR-T细胞对这些TYRP1阴性细胞系没有反应性，证实了CAR-T细胞的抗原特异性。研究还通过20D7S抗体对35种不同供体的人类组织进行结合特性分析，发现肾脏小管内有细胞外TYRP1染色，但其他组织未观察到TYRP1染色，表明肾脏可能是潜在的低风险脱靶器官。
图6展示了20D7SL-28ζ CAR-T细胞在免疫能力正常的C57BL/6小鼠B16黑色素瘤模型中对肿瘤的强控制作用且无毒性。实验中，接受20D7SL-28ζ CAR-T细胞治疗的小鼠在体重和体温方面没有显著变化，血液指标在照射后有所下降但随后恢复，且未观察到与治疗相关的毒性。此外，治疗后小鼠的视网膜外核层厚度和视网膜色素上皮细胞中的TYRP1表达没有变化，表明治疗未对正常色素细胞产生毒性。这些结果进一步证实了20D7SL-28ζ CAR-T细胞疗法在抑制肿瘤的同时具有良好的安全性。
图7展示了20D7SL-28ζ CAR-T细胞疗法在治疗罕见黑色素瘤亚型，包括肢端和葡萄膜黑色素瘤方面显示出显著的抗肿瘤效果。通过建立肢端和葡萄膜黑色素瘤细胞系的TYRP1表达水平，并与高TYRP1表达的皮肤黑色素瘤细胞系进行比较，研究发现所有五种葡萄膜黑色素瘤细胞系均表现出高TYRP1表达，且这些细胞系被20D7SL-28ζ CAR-T细胞有效裂解。在不同效应细胞与靶细胞比例的共培养中，20D7SL-28ζ CAR-T细胞的激活表现为CD8+ T细胞和CD4+ T细胞上4-1BB和OX-40的过表达。类似地，两种高TYRP1表达的肢端黑色素瘤细胞系与20D7SL-28ζ CAR-T细胞共培养后，也显示出细胞毒性以及CD8+ CAR-T细胞和CD4+ CAR-T细胞上4-1B和OX-40的上调。在免疫缺陷的NSG小鼠中进行的体内实验进一步证实，20D7SL-28ζ CAR-T细胞能够有效控制MP41和MP46葡萄膜黑色素瘤以及SK-Mel709B肢端黑色素瘤的生长，并在所有肿瘤模型中产生了100%的完全反应。这些结果支持了20D7SL-28ζ CAR-T细胞疗法在治疗罕见黑色素瘤亚型中的潜在应用。
在本研究中，作者团队将酪氨酸酶相关蛋白1 （TYRP1）确定为CAR-T细胞疗法的靶点，用于治疗对免疫检查点阻断无反应的皮肤和罕见黑色素瘤亚型患者。
本研究提出了一种针对高TYRP1过表达的黑色素瘤患者的CAR-T细胞疗法，该疗法通过靶向TYRP1表面表达，已在临床前模型和临床试验中显示出疗效。这为对免疫检查点阻断疗法产生原发性或获得性耐药的患者来说，是一个新的生存机会。研究团队采用迭代设计方法，优化了CAR设计，使其能够识别并靶向低水平的TYRP1表达，从而在体外和体内模型中诱导CAR-T细胞激活和强大的抗肿瘤活性。这种策略的成功为开发针对其他癌症类型的CAR-T细胞疗法提供了新的可能性。
