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传统的实验动物繁殖方法并不能有效地控制后代的性别比例，这限制了性别特异性研究的开展。在畜牧业中，不同产业对动物性别有不同偏好，如乳业需要雌性，肉牛业偏好雄性，猪养殖中雄性存在肉味问题。产生和淘汰不需要性别的动物不仅造成资源浪费，也引发动物福利问题。因此，迫切需要开发新的方法来产生单性动物后代。CRISPR-Cas9技术作为一种基因编辑工具，能够高效地对特定基因进行敲除或修改，通过精确的基因操作，可以实现对动物性别的控制，从而产生单性别的后代，这对于提高研究效率和改善动物福利都具有积极作用。2.1 Top1 sgRNA筛选及相关验证：研究团队以小鼠作为模型生物，在体外CRISPR - Cas9双组分系统诱导Top1突变的实验中，针对Top1的不同区域设计了sgRNA（sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3）并转染到表达Cas9的雄性小鼠胚胎干细胞（mESCs）中，通过FACS筛选和测序分析，发现sgRNA2的突变效率最高，达到52%（图1a、b）。并且最常见的突变是在Cas9切割位点 - 1位置的插入单个核苷酸，该突变会提前产生终止密码子。western blotting证实了sgRNA2转染后的细胞中TOP1蛋白表达缺失（图1c）。2.2 常染色体sgRNA和Cas9转基因的共遗传诱导Top1突变和胚胎致死：研究团队构建了X 整合的sgRNA2 - mCherry转基因小鼠模型（XTop1Y），利用qPCR和western blotting证实mCherry在XTop1Y成年组织中的表达（图1d、e）。为了探究这种转基因是否会在母体Cas9存在下诱导女儿的致死性，将XTop1Y雄性与纯合的R26Cas9雌性交配（图1f），在出生时对后代进行基因分型，子代全部为雄性（n = 111只幼崽，n = 25窝）（图1g），表明X整合的Top1 sgRNA和Cas9共遗传可100%诱导雌性致死。
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图1 Top1向导的筛选和XTop1小鼠的产生
2.3 常染色体sgRNA - mCherry功能验证：将sgRNA2 - mCherry转基因插入到常染色体Hipp11（H11）位点构建H11Top1小鼠，通过体内成像和qPCR证实mCherry表达。将H11Top1 / +雄性与纯合的R26Cas9雌性交配，在E3.5时，H11Top1 / R26Cas9和 + / R26Cas9胚胎回收比例相同（n = 33），且H11Top1 / R26Cas9胚胎有Top1突变，但出生时所有幼崽均为 + / R26Cas9（n = 80只幼崽，n = 17窝），证明常染色体sgRNA2 - mCherry与R26Cas9共遗传可100%诱导胚胎致死，即常染色体sgRNA - mCherry在体内有功能（图2）。
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2.4 使用性染色体连锁Cas9转基因产生单性别窝仔：研究团队构建了在X染色体（XCas9Y）和Y染色体（XYCas9）表达Cas9 - eGFP的转基因小鼠系。将XCas9Y雄性（仍携带Cas9 - eGFP转基因中的新霉素盒组件）与纯合的H11Top1雌性交配，103只后代中有102只（99%）为雄性，唯一的雌性是XO型，是由于未继承父本X染色体上的Cas9 - eGFP转基因。去除新霉素盒后，XCas9Y或XYCas9雄性与纯合H11Top1雌性交配，XCas9Y交配产生的幼崽全部为雄性（n = 130只幼崽，n = 36窝），XYCas9交配产生的幼崽全部为雌性（n = 120只幼崽，n = 36窝），成功产生了单性别幼崽（图3）。在上述构建双组分系统的四次迭代交配实验中，虽然理论上Cas9和Top1 sgRNA2共遗传诱导的胚胎致死会使平均窝仔数减少50%，但实际研究的四次交配中，后代数量均高于50%，表明存在对胚胎损失的补偿现象。
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图3 检查XCas9和YCas9产生单性别窝仔的功能2.5 性连锁Cas9转基因可产生出生后性别特异性表型：以Atm基因为例，将野生型雌性与XCas9Y或XYCas9雄性交配产生受精卵，然后用电穿孔法导入Atm激酶结构域靶向的sgRNA并移植到假孕母鼠体内。在XCas9Y父亲的交配中，Atm突变仅在雌性后代中诱导产生；在XYCas9父亲的交配中，Atm突变仅在雄性后代中诱导产生。Atm突变雌性后代的平均突变效率为99.3%（n = 7），雄性后代为94.6%（n = 22）。Atm突变雌性在产后8周卵巢萎缩且无卵母细胞，Atm突变雄性睾丸中生殖细胞在中期粗线期停滞，生精小管中无精子且睾丸重量低于野生型雄性，染色体铺展分析显示Atm突变体有预期的染色体断裂和持续的DNA损伤模式（图4）。因此，除了在产生单性别窝仔中的效用之外，XCas 9/YorXYCas 9模型可用于产生其他性别特异性表型。
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图4 靶向Atm的sgRNA的瞬时引入产生性别特异性表型该研究提出了一种100%有效的方法，用于实现后代性别选择和后代性别特异性表型的产生，这在原则上适用于具有分化性染色体的任何物种。该研究通过CRISPR-Cas9技术将Cas9基因与Top1 sgRNA2系统结合，实现了对胚胎的性别选择，能够产生全雄性或全雌性的后代。尽管这种基因编辑导致的胚胎致死性应该会使平均窝仔数减少50%，但实际上窝仔数的补偿程度较高，均高于50%。作者还探讨了性别连锁Cas9转基因模型在创建性别特异性表型方面的潜力，以Atm基因为例，展示了如何通过性别特异性的基因敲除来研究不同的生物学过程。这些发现不仅证实了CRISPR-Cas9技术在生殖生物学和遗传学研究中的应用潜力，也为未来的性别特异性研究提供了新工具。
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