肺癌是常见且难治疗的恶性肿瘤之一。尽管现在有一些相应的治疗手段，但与肺癌相关的存活率仍然很低，这表明迫切需要新的和更有效的治疗方法，例如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞免疫疗法。作为热休克蛋白 70 (HSP70) 超家族的一员，葡萄糖调节蛋白78 (GRP78) 已被证明是内质网 (ER) 中的分子伴侣，主要响应正常细胞中的 ER 应激。而细胞表面葡萄糖调节蛋白78（csGRP78）在各种血液系统恶性肿瘤和实体瘤细胞中表达，包括肺癌。在本篇文章中，作者团队主要研究csGRP78作为治疗靶点的潜力。
图1展示了通过免疫荧光分析在人类肺癌细胞系A549和H1299中GRP78的细胞表面表达和定位。图A显示，使用抗GRP78抗体和Cy3结合的二抗进行染色后，两个细胞系均显示出明显的csGRP78信号，其中A549细胞的表达百分比为90%，H1299细胞为89%。作为对照，仅用Cy3结合的二抗染色的细胞（CON）未显示GRP78的信号。图B进一步通过同时染色csGRP78和细胞膜标志物β-catenin来精确定位GRP78，结果显示GRP78与β-catenin在细胞表面共定位，共定位信号在合并图像中以黄色显示，由箭头指示。这些结果证实了GRP78在肺癌细胞表面的显著表达，并为后续针对csGRP78的CAR-T细胞疗法研究提供了基础。
图2展示了针对表达csGRP78的肺癌细胞系A549和H1299的Pep42-BBZ CAR-T细胞的构建、转导效率、T细胞表型分析以及杀伤能力。图A展示了CAR的结构，包括Pep42肽段、4-1BB共刺激序列和CD3ζ激活域，以及作为标记的远红荧光蛋白mkate2。图B通过流式细胞术检测了三种组别（未转导的T细胞、mock-BBZ CAR-T细胞和Pep42-BBZ CAR-T细胞）的CAR阳性T细胞的转导效率，结果显示Pep42-BBZ CAR阳性T细胞的平均转导效率为53.5 ± 1.8%，与mock-BBZ CAR阳性T细胞的51.5 ± 2.9%相当。图C和D通过流式细胞术分析了T细胞亚群标志物，发现Pep42-BBZ CAR-T细胞组与mock-BBZ CAR-T细胞组在CD4+和CD8+ T细胞亚群以及效应记忆T细胞（TEM）和中央记忆T细胞（TCM）亚群上没有显著差异。图E展示了Pep42-BBZ CAR-T细胞与肺癌细胞共培养的杀伤实验，结果显示Pep42-BBZ CAR-T细胞在剂量依赖性方式下显著裂解A549和H1299细胞。图F通过ELISA检测了IFN-γ的释放水平，证实了Pep42-BBZ CAR-T细胞与肺癌细胞共培养后IFN-γ水平显著升高，表明Pep42序列在CAR结构中被肿瘤抗原csGRP78识别，从而促进CAR-T细胞杀死肺癌细胞系。这些数据表明Pep42-BBZ CAR-T细胞对表达csGRP78的肺癌细胞具有细胞毒性。
图3展示了Pep42-BBZ CAR-T细胞对肺癌干细胞（CSCs）的细胞毒性。图A通过实时定量PCR检测了A549和H1299细胞及其衍生的CSCs中三个干细胞标志物（CD133、SOX2和Nanog）的表达水平，结果显示这些标志物在CSCs中的表达显著增加。图B通过免疫荧光分析显示了A549和H1299 CSCs表面csGRP78的表达。图C展示了Pep42-BBZ CAR-T细胞对A549和H1299 CSCs的细胞毒性，与mock-BBZ CAR-T细胞相比，Pep42-BBZ CAR-T细胞在E:T比例为4:1时能显著杀死大约50%的A549 CSCs和80%的H1299 CSCs。图D通过ELISA检测了共培养系统中IFN-γ的释放水平，结果显示Pep42-BBZ CAR-T细胞共培养组的IFN-γ水平显著高于mock-BBZ CAR-T细胞组。这些结果表明Pep42-BBZ CAR-T细胞能够通过识别csGRP78有效且特异性地杀死肺癌CSCs。
图4展示了Pep42-BBZ CAR-T细胞在体内对A549肿瘤异种移植物的消除效果。图A描述了肿瘤异种移植物实验设计，NCG小鼠被皮下注射表达荧光素酶报告基因的A549细胞。五天后，小鼠被随机分为三组，分别注射未转导的T细胞（NTD）、mock-BBZ CAR-T细胞或Pep42-BBZ CAR-T细胞。每周使用体内成像软件（IVIS）进行成像。图B显示了A549肿瘤异种移植物切片中csGRP78的免疫荧光染色，证实了肿瘤细胞内csGRP78的表达。图C展示了IVIS成像的肿瘤生物发光图像，图D和E分别展示了三组小鼠肿瘤生物发光和体积进展曲线。与NTD或mock-BBZ CAR-T组相比，接受Pep42-BBZ CAR-T细胞治疗的小鼠肿瘤体积显著减小，到第14天，六只小鼠中有五只的肿瘤无法被扫描检测到。此外，对Pep42-BBZ CAR-T细胞治疗组的小鼠进行了长达63天的观察，未观察到肿瘤复发。图F展示了肿瘤组织切片中ki67和裂解的caspase-3的免疫荧光染色，与mock-BBZ CAR-T组相比，Pep42-BBZ CAR-T组显示出减弱的肿瘤细胞增殖和增强的肿瘤细胞凋亡。图G和H分别展示了肿瘤组织切片中T细胞和肺癌干细胞标志物CD133的免疫荧光染色，结果表明Pep42-BBZ CAR-T细胞能够渗透到肿瘤中并杀死肿瘤细胞和CSCs，最终消除肿瘤。这些数据表明Pep42-BBZ CAR-T细胞能够杀死A549衍生的肿瘤异种移植物中的肿瘤细胞和CSCs，最终消除肿瘤。
图5展示了Pep42-BBZ CAR-T细胞对正常器官的安全性。图A通过H&E染色展示了健康小鼠、mock-BBZ CAR-T细胞组和Pep42-BBZ CAR-T细胞组的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和大脑组织的组织学特征，结果显示与健康小鼠相比，两组CAR-T细胞处理的小鼠的这些器官没有异常。图B通过免疫荧光染色展示了肝脏和肺组织中T细胞的浸润情况，使用CD3ζ抗体进行染色，结果显示在Pep42-BBZ CAR-T细胞治疗组中，肺和肝脏血管腔中的一些细胞显示出少量的CD3ζ免疫反应性。这表明Pep42-BBZ CAR-T细胞特异性地靶向肿瘤细胞，同时保留正常组织。
这篇文章研究了针对肺癌的新型免疫疗法，特别是利用嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）技术靶向细胞表面葡萄糖调节蛋白78（csGRP78）。作者团队先是通过免疫荧光检测了肺癌细胞系A549和H1299以及A549衍生的癌症干细胞样细胞中csGRP78的显著表达。接下来，构建了一个针对csGRP78的CAR，并测试了转导的CAR-T细胞杀死这两种肺癌细胞系和衍生的干细胞样细胞的效力，这与体外特异性干扰素γ的释放相关。最后，发现csGRP78 CAR-T细胞可以高效地杀死了肺癌细胞和癌症干细胞样细胞，导致体内肿瘤异种移植物的消除，且在清除肿瘤63天后没有观察到肿瘤复发。这些CAR-T细胞对正常器官没有显示出明显的毒性，表明它们具有较好的安全性。作者团队的研究揭示了csGRP78作为治疗靶点的潜力，并为开发csGRP78 CAR-T细胞作为肺癌潜在治疗方法提供了宝贵的见解。
