一、引言
细胞治疗产品为疾病治疗带来新希望，而细胞计数在其开发和质量控制中至关重要。国际标准化组织（ISO）及相关机构不断推进细胞计数标准的制定和实践交流。准确的细胞计数面临诸多挑战，本文将深入探讨并提出应对策略。
二、细胞计数的复杂性
（一）细胞制剂的复杂性
1. 多样的细胞群体和污染物
- 细胞制剂包含多种细胞群体，还有细胞碎片等污染物。区分活细胞与死细胞困难，因为它们之间的界限不明确，且不同细胞类型的特性差异大。
- 例如间充质干细胞（MSCs）比T细胞大且大小不均，人诱导多能干细胞（hiPSCs）易聚集，都需不同计数方法。
2. 悬浮介质的影响
- 悬浮介质如培养基、洗涤液和冷冻保护剂等会影响计数。二甲基亚砜（DMSO）会使吖啶橙（AO）荧光复杂，导致细胞数量低估（浅谈DMSO对于基于AO染料的细胞计数影响）；盐溶液会影响AO与DNA结合，减少可观测细胞数（浅谈水溶液中盐对吖啶橙荧光淬灭的影响）。使用磷酸盐缓冲液（PBS）或氯化钠注射液会使刚收获的T细胞浓度降低。
（二）计数目的和方法的多样性
1. 不同的计数目的
- 包括过程估算（如传代、培养维持的进料速率）和对细胞活力的评估（作为治疗效力指标）等，各目的对精度和准确性要求不同。
2. 多样的计数方法
- 有血细胞计数器、自动化系统（如图像分析和阻抗细胞计数器）、流式细胞术、平板接种及菌落形成单位（CFU）计数、分光光度法、基于DNA含量量化和代谢活动检测等方法。每种方法都有优缺点，如血细胞计数器手动操作耗时且易受人为误差影响，自动化系统虽高效但成本高。
三、影响细胞计数的关键因素及提高准确性的策略
（一）关键因素
1. 方法选择影响结果
- 不同计数方法和染色染料会产生不同的细胞计数和活力结果。例如，台盼蓝拒染法和流式细胞术在检测外周血祖细胞（PBPCs）白细胞活力时有差异，手动台盼蓝拒染试验在某些情况下更可靠，但自动细胞计数器在重复性和精度上有优势。
2. 样品处理影响准确性
- 混合和取样过程复杂，处理不当会使样本不具代表性。样品制备阶段细胞簇或聚集体处理不好会导致不均匀取样或细胞损伤。细胞损伤可能延迟显现，解冻后立即评估活力可能高估。
（二）提高准确性的策略
1. 选择合适的计数方法
- 遵循“适合目的”原则，全面了解样品，评估计数方法对目标细胞的选择性，考虑对计数结果的容忍度。例如，杨等人对解冻后外周血造血祖细胞（HPCs）活力研究选择合适方法，陈等人提出准确测量外周血单核细胞（PBMC）浓度的方法。
2. 优化计数方案及验证方法
- 包括选择合适计数方法、优化方案、严格验证方法（涵盖特异性、准确性、精度等方面）和建立测量保证程序。
3. 过程控制
- 采用安装确认（IQ）、操作确认（OQ）和性能确认（PQ）等措施，使用参考珠子、正交方法，坚持日常校准和数据审查，实施重复检测策略等。
四、细胞计数方法在细胞治疗产品中的应用及释放标准
（一）不同产品的计数方法
1. 多种计数技术应用
- 对间充质干细胞（MSC）产品，常用自动化图像细胞计数器、手动计数室和流式细胞术等；对T和NK细胞，采用自动化图像细胞计数器、手动计数室、自动血液分析仪和流式细胞术等。
2. 不同产品的特点
- CAR - T产品需监测污染物确保纯度，MSC产品存在异质性，iPSCs需准确测量细胞聚集体。
（二）释放标准
1. 细胞计数和活力要求
- 需进行释放测试评估细胞计数/剂量和活力。FDA倡导最低细胞活力标准通常为70%，不同产品有不同要求。如tisagenlecleucel对剂量和活力有规定，HPC产品和Prochymal也有相应标准。
2. 应对偏差
- 若结果不符合标准，需提供支持数据说明产品安全性和有效性不受影响。
细胞计数常常被当做一个很小的实验去对待，因此有时候很容易被实验人员忽视。随着细胞疗法的发展，越来越多的学者加入了细胞计数方法的研究之中，揭示了细胞计数的复杂与重要性。因此，实验人员需要对细胞计数给予同样的重视。
当实验人员发现计数结果与预期值存在较大误差之时，应当从人机料法环五个方面去评估和排查。误差往往会来自平时注意不到的地方。
津禾生物为您提供细胞计数解决方案：来自丹麦ChemoMetec广受欢迎的产品NucleoCounterNC200/202/250/3000等机型。
上海津禾生物科技有限公司（https://www.sinobiotool.com/）成立于2018年，是国内细胞与基因治疗，疫苗和干细胞产业领先的设备供应商，成立6年来专注服务生物医药企业，服务超过500家客户，提供涵盖从早期研发到商业化生产全生命周期的解决方案。
上海津禾生物科技有限公司
15921763968 | 17891962538
sbt001@sinobiotool.com
津禾公众号，扫码点关注
