在心血管疾病的研究领域，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的增殖、迁移和自噬等生物学过程已被广泛认识和深入研究。这些过程在血管重构性疾病的发生发展中扮演着关键角色。
一起来看河北医科大学生物化学与分子生物学教研室孙绍光教授团队发表在Journal of Advanced Research（IF=10.7）的文章，如何讲述hsa_circ_0001402通过海绵吸附miR-183-5p，抑制VSMC增殖和迁移，激活VSMC自噬，从而抑制血管内膜增生的故事。
文章题目：Hsa_circ_0001402 alleviates vascular neointimal hyperplasia through a miR-183-5p-dependent regulation of vascular smooth muscle cell proliferation, migration, and autophagy
本文主要研究的内容？
鉴定了一种可同时调控血管平滑肌细胞（VSMC）增殖、迁移和自噬的circRNA。具体而言，hsa_circ_0001402通过海绵吸附miR-183-5p，靶向FKBPL抑制VSMC增殖和迁移，靶向BECN1激活VSMC自噬，从而抑制血管内膜增生。
研究中的关键点有哪些？
血管内膜增生(研究疾病)是心血管疾病如动脉粥样硬化和肺动脉高压的病理过程。VSMCs（研究细胞）的增殖、迁移和自噬（生物学过程）与内膜病变（病理事件）的发展有关。circRNAs（关键分子）在调节VSMCs的增殖和迁移中起着关键作用，但它们在VSMCs自噬中的调控作用尚不清楚。
作者通过芯片数据（GSE77278）得到PDGF-BB诱导的HASMC中差异表达的134个circRNA结合circBank和circAtlas 2.0数据库得到57个在人鼠之间保守的circRNA。挑选了hsa_circ_0001402进行进一步研究，并且检测到PDGF-BB诱导的增殖型HASMC中hsa_circ_0001402表达下降。
Sanger测序证实hsa_circ_0001402来源于TBC1结构域家族成员1（TBC1D1）基因的第13至15外显子，hsa_circ_0001402对降解具有强大的抵抗力，而线性TBC1D1 mRNA几乎完全降解，证实了hsa_circ_0001402的环状特性。使用转录抑制剂放线菌素D的处理表明，与线性TBC1D1 mRNA相比，hsa_circ_0001402具有更强的稳定性和更长的半衰期，并且验证hsa_circ_0001402大量存在细胞质中。
图注：hsa_circ_0001402的鉴定
如何做功能探究？想必大家也都知道，就是敲降过表达后看细胞的表型变化。这里作者对hsa_circ_0001402进行过表达，发现能够抑制HASMC的增殖/迁移以及MMP9、MMP2的表达，并且能够激活HASMC的自噬。
图注：Hsa _ circ _ 0001402过表达抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移，同时促进血管平滑肌细胞自噬
3. hsa_circ_0001402通过什么机制去影响VSMC的功能？
因为hsa_circ_0001402主要存在于细胞质中，所以作者优先考虑了其作为miRNA海绵的可能性，通过CircInteractome及miRDB数据库鉴定出3个可能被hsa_circ_0001402海绵化的miRNA（miR-183-5p、miR-136-5p和miR-188-3p）。而且miR-183-5p能够促进VSMC的增殖迁移同时抑制VSMC的凋亡，并且能够结合细胞增殖/迁移相关FKBPL的编码区。
首先作者验证了miR-183-5p在增殖型HASMC中的表达升高。联合Western blot、EdU和CCK-8、细胞划痕和双荧光素酶报告基因分析，证明过表达miR-183-5p通过靶向FKBPL CDS抑制FKBPL蛋白表达水平，从而促进HASMC增殖和迁移。相反，敲减miR-183-5p能够上调FKBPL，从而抑制VSMC增殖和迁移。总的来说，miR-183-5p通过靶向FKBPL的编码序列来降低FKBPL水平，从而在HASMC上发挥其促进增殖和促进迁移的作用。
除了FKBPL外，miR-183-5p还能够结合自噬相关BECN1的3′-UTR，PCR结果表明，miR-183-5p在诱导自噬的VSMC中表达降低，并且过表达miR-183-5p能够靶向BECN1 3′-UTR抑制BECN1蛋白表达水平，从而抑制VSMC自噬，相反敲减之后能够上调BECN1，从而激活VSMC自噬。总的来说，miR-183-5p通过下调BECN1蛋白表达水平，抑制VSMC自噬。
图注：MiR-183-5p 通过降低 FKBPL 水平促进血管平滑肌细胞增殖和迁移。
图注：miR-183-5p靶点的获取
图注：miR-183-5p 通过降低 BECN1水平抑制 VSMC 自噬
4. 体内验证上述机制
体外做完了当然要做体内实验来提升我们的文章档次。作者用的是颈总动脉结扎模型，首先现在内膜增生血管中验证miR-183-5p的表达升高。然后原位递送miR-183-5p agomir过表达miR-183-5p，发现过表达之后FKBPL和BECN1水平下调并且促进了血管内膜增生。而敲减miR-183-5p之后FKBPL和BECN1水平上调抑制血管内膜增生。
图注：过表达 miR-183-5p 通过降低 FKBPL 和 BECN1水平加重新生内膜增生。沉默 miR-183-5p 通过增加 FKBPL 和 BECN1水平减轻新生内膜增生。
5. 过表达hsa_circ_0001402通过海绵吸附miR-183-5p上调FKBPL和BECN1表达
联合qRT-PCR和双荧光素酶报告基因分析，过表达hsa_circ_0001402能够通过海绵吸附miR-183-5p来降低其表达。WB、EdU、CCK-8、细胞划痕的挽救实验，证实过表达miR-183-5p能够回补过表达hsa_circ_0001402对HASMC增殖和迁移的抑制，从而促进HASMC增殖和迁移。WB和双荧光素酶报告基因分析，证实过表达hsa_circ_0001402能够海绵吸附miR-183-5p，减少miR-183-5p对FKBPL的靶向抑制，从而升高FKBPL蛋白水平。敲减FKBPL能够回补过表达hsa_circ_0001402对VSMC增殖和迁移的抑制。过表达miR-183-5p能够回补过表达hsa_circ_0001402对VSMC自噬的激活。WB和双荧光素酶报告基因分析，证明过表达hsa_circ_0001402能够海绵吸附miR-183-5p，减少miR-183-5p对BECN1的靶向抑制，从而升高BECN1蛋白水平。综上所述，hsa_circ_0001402通过hsa_circ_0001402/miR-183-5p/FKBPL轴和hsa_circ_0001402/miR-183-5p/BECN1轴在VSMC中发挥作用。
图注：hsa_circ_0001402的过表达通过海绵吸附 miR-183-5p 增加 FKBPL 和 BECN1水平。
简单的免疫荧光验证出，过表达hsa_circ_0001402能够上调FKBPL和BECN1抑制血管内膜增生。
RNA稳定性分析:文中主要用了两种方法，RNase R消化实验来确定RNA的环状结构，RNase R能够降解线性RNA但不能降解环状RNA。放线菌素D评估RNA的稳定性，本质上使通过抑制DNA依赖的RNA聚合酶，从而阻断RNA的转录过程，如果某个RNA分子在放线菌素D处理后其水平下降得较慢，说明它具有较长的半衰期和较高的稳定性。
自噬流分析: 使用mRFP-GFP-LC3质粒共转染来评估自噬体和自噬溶酶体的数量。这应该非常好理解，就是通过荧光标记来评估自噬发生的情况。
双荧光素酶报告基因检测: 用于验证circRNA与miRNA之间的相互作用。本文中主要是构建含有hsa_circ_0001402野生型（WT）或突变型（MUT）序列的载体，以及含有FKBPL或BECN1基因的3'非翻译区（3'UTR）的载体。将这些载体与miR-183-5p mimic或抑制剂共转染入细胞。通过检测荧光素酶活性，评估miR-183-5p对hsa_circ_0001402、FKBPL和BECN1的影响。
1. 发现新的血管平滑肌功能调节机制：hsa_circ_0001402/miR-183-5p/FKBPL轴和hsa_circ_0001402/miR-183-5p/BECN1轴的发现，为血管平滑肌功能调节提供了新的分子机制。
2. 潜在治疗靶点的发现：hsa_circ_0001402、miR-183-5p、FKBPL和BECN1可能成为治疗内膜增生相关心血管疾病的新的分子靶点。
图片来源：Hsa_circ_0001402 alleviates vascular neointimal hyperplasia through a miR-183-5p-dependent regulation of vascular smooth muscle cell proliferation, migration, and autophagy - ScienceDirect
其实类似的文章有很多，下文光看题目其实跟本文其实区别不大，但查看方法学后你就会发现为什么下文能够发在心血管顶刊上。一是基因敲除鼠的应用，构建了Tet2flox/flox/Tagln-Cre 小鼠和miR-22 KO小鼠。二是人类样本的验证，整体拉高了文章的证据级别。
图片来源：Pubmed
思路概括出来就是这样：先确定所要研究的疾病以及表型，再通过公共数据挖掘确定想要研究的目标分子，验证此分子对于疾病表型的影响，通过其特性挖掘或数据库预测其下游分子（这里就是circRNA-miRNA-mRNA这么一个ceRNA网络）。然后对目标分子及其下游分子进行敲减过表达，在体内外验证他们之间的互作关系以及对疾病的影响。
参考文献：
1. Lin JJ, Chen R, Yang LY, Gong M, Du MY, Mu SQ, Jiang ZA, Li HH, Yang Y, Wang XH, Wang SF, Liu KX, Cao SH, Wang ZY, Zhao AQ, Yang SY, Li C, Sun SG. Hsa_circ_0001402 alleviates vascular neointimal hyperplasia through a miR-183-5p-dependent regulation of vascular smooth muscle cell proliferation, migration, and autophagy. J Adv Res. 2024 Jun;60:93-110. doi: 10.1016/j.jare.2023.07.010
