中性粒细胞是大家研究比较多的一类免疫细胞，围绕中性粒细胞有关的科研热点也很多，如中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）、中性粒细胞与其它细胞交互、中性粒细胞代谢重编程、中性粒细胞的程序性死亡（如铁死亡）、肿瘤相关中性粒细胞、中性粒细胞衰老等等。而今天我们通过一篇文献来介绍一个新的方向：中性粒细胞的逆向跨内皮迁移（rTEM）。
来源：https://www.scienceopen.com/document?vid=da181d3d-2d54-4e8d-9ecf-da2eeed97330
中性粒细胞的逆向跨内皮迁移（Reverse Transendothelial Migration, rTEM）是指中性粒细胞在完成炎症部位的任务后，从组织中返回到血管内的过程。这种现象在无菌性炎症情况下，如缺血再灌注、自身免疫性疾病、高脂饮食、吸烟等情况下发生。但是，中性粒细胞逆向迁移至周围正常组织和肺内，可能导致进一步的损害。例如，在脓毒症时，中性粒细胞可从炎症部位反向迁移至脉管系统，这一过程被称为反向跨内皮迁移（rTEM）。经历rTEM的中性粒细胞功能显著激活且存活时间长，可以引发远端肺部炎症和损伤。
近日来自东南大学邱海波/巢杰团队在Advanced Science（IF 14.3）发表文章，讲了一个有关内皮细胞释放的细胞外囊泡（EVs）与中性粒细胞rTEM的故事，大家且随小编看看这类故事应该如何讲，才能讲的好。
图源：Advanced Science
一、主要研究内容
本文研究了什么？
一句话概括就是：内皮细胞来源的细胞外囊泡（EVs）如何促进中性粒细胞的逆向跨内皮迁移（rTEM），以及这一过程如何与脓毒症相关的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的发生有关。
研究中的关键点有哪些？
具体来说：在脓毒症状态（研究病种）下，活化的内皮细胞（关键细胞1）通过释放含有KPNB1（关键分子）的EVs，促进了中性粒细胞（关键细胞2）的rTEM（生物学过程），进而导致远端肺损伤（病理事件）。
二、科学问题
1、 作者如何在脓毒血症模型中定位到rTEM中性粒细胞的？又是如何验证这群细胞与疾病关联的？
首先作者做了一个经典的脓毒症小鼠模型（通过盲肠结扎、穿刺来诱导），并通过scRNA-seq对脓毒症小鼠肺部组织进行发现，发现了一群有意思rTEM为表型的中性粒细胞（表面marker有高表达ICAM1、CXCR4，低表达CXCR1）。
为了验证相关性，作者在脓毒症患者的血液中检测了具有rTEM表型的中性粒细胞，提示细胞比例与疾病的严重程度正相关。此外，作者将具有rTEM表型的中性粒细胞通过静脉注射过继到正常小鼠体内，观察这些细胞在体内的分布和对肺的影响，进而通过共聚焦活体显微镜来观察中性粒细胞在小鼠体内的迁移和与血管内皮的相互作用。
图注：脓毒症肺组织的scRNA-seq分析揭示rTEM中性粒细胞亚群
2、作者是如何想到去研究EV的，又是如何发现与中性粒细胞之间关系的？
大家先思考一个问题，考虑到中性粒细胞和内皮细胞这么紧密的关联，大家是不是会首先想到细胞外是否存在介质？那么EVs很可能就是这个介质。另外，已有的研究也表明，EVs确实参与了免疫细胞的激活和迁移，这就促使作者进一步去研究一下这之间是否存在关联。
进一步的验证，作者就分成了体外和体内两个部分：
体外实验作者将经过脂多糖（LPS）刺激的内皮细胞培养上清中提取EVs（当然你得验证你提取的EVs确实是EVs，这里就不再赘述），并与中性粒细胞共培养，观察EVs对中性粒细胞表型、迁移能力和活化状态的影响。
体内实验中，作者将标记的EVs通过静脉注射到正常小鼠体内，利用活体成像技术观察EVs在体内的分布和中性粒细胞的迁移。共聚焦活体显微镜（IVM）技术观察中性粒细胞在肺微循环中的动态行为，包括它们与血管内皮的相互作用和迁移过程。（这一系列步骤是成流程的关于EVs的功能性验证，大家可以留意一下）
图注：EC来源的EVs在体内将中性粒细胞重编程为rTEM中性粒细胞表型并导致肺损伤
3、作者是怎么验证EVs调控中性粒细胞的具体机制的？
对EVs进行质谱分析，鉴定其中含有的蛋白质，特别是那些与中性粒细胞迁移和活化相关的蛋白，如中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和连接粘附分子-C（JAM-C）；接下来使用抑制剂或者敲除的手段抑制NE的表达，来观察是否对JAM-C蛋白水平和中性粒细胞迁移是否有影响。（实际上这条通路是已经存在，并且其他研究者已经证实过的，作者为了将故事讲的圆满一些，故而又做了这条通路）
图注：EVs通过上调NE和降解JAM-C来促进rTEM中性粒细胞。
4、一个故事讲的好，最后还得回归临床！
所以，作者最后收集了脓毒症及健康对照人群的血样，看了看EVs浓度和rTEM中性粒细胞的关系，临床上也实锤：EVs与中性粒细胞的异常迁移、ARDS的严重程度高度相关。至此，故事就讲完了，也告诉了大家，我这个研究是有临床转化价值的，这是一个不错的故事。
图注：脓毒症相关ARDS患者血浆 EC来源EVs增多
三、关键实验技术
纳米流式细胞定量分析EVs：这个作用就不多说了（还是说一下吧~分析EVs的浓度、大小分布和表面marker）研究EVs的必备。
共聚焦活体显微镜：用来观察中性粒细胞在小鼠模型中的迁移和跨内皮细胞行为。
其他的一些技术就是小鼠的造模，蛋白的检测，抑制剂/敲除模型的使用，单细胞分析的使用等等。
四、研究亮点
1、为两个细胞的作用提供新的视角：内皮细胞来源的EVs在促进中性粒细胞的rTEM，并且是以脓毒症为研究背景，能为临床提供新的诊疗视角（当然要实现转化还有很长的路要走）。
2、叙述故事的逻辑很吸引人：本文显示通过对构建的脓毒症小鼠模型的肺部进行单细胞分析，随后又回到在细胞和小鼠模型中验证，期间所用的验证手段也都是最经典的（不管是模型的构建，还是EVs的验证，通路的挖掘），思路很流畅，最后再回归临床。这样的思路会使文章在审稿人心中的得分大大提高。
五、思路拓展
让我们来看一篇思路非常相近的文章，光从题目我们就可以发现重点：内皮细胞来源的EVs（这里不太一样的一点是明确了VCAM1为marker的内皮细胞），通过重编程的方式（上文影响的是rTEM）影响单核细胞（上文影响的是中性粒细胞），最后定位的病理过程是脓毒症导致的急性肺损伤（所研究的疾病基本上是一样的）。
图片来源：Pubmed
具体而言，作者首先观察到脓毒症小鼠血浆中的EC-EVs数量显著增多。进一步的实验表明EC-EVs表面高表达VCAM1，能与单核细胞表面的整合素亚单位α4（ITGA4）相互作用，激活NF-κB信号通路，促使单核细胞向M1型巨噬细胞分化，这一过程同脓毒症相关ARDS的严重程度密切相关。（这里的研究思路是从EVs入手，再引出相互作用的单核细胞。而上文的思路是从脓毒症小鼠的单细胞入手，先发现了一群特殊的rTEM中性粒细胞，然后再通过文献调研，去探索是否是EVs联系着内皮细胞与中性粒细胞。）
其实这类有关内皮细胞释放的EVs文章，先得定性一个疾病（如上面两篇都是脓毒症相关ARDS），且必须找到一个被EVs所影响的细胞（一篇是中性粒细胞，一篇是单核细胞），并且弄明白到底是影响了哪个方面（迁移？分化？重编程？），而后挖掘其中的机制通路，最后再回归临床，指导临床，将故事讲得圆满，如此，一篇好的文章便诞生了。
参考文献
1.Zi SF, Wu XJ, Tang Y, Liang YP, Liu X, Wang L, Li SL, Wu CD, Xu JY, Liu T, Huang W, Xie JF, Liu L, Chao J, Qiu HB. Endothelial Cell-Derived Extracellular Vesicles Promote Aberrant Neutrophil Trafficking and Subsequent Remote Lung Injury. Adv Sci (Weinh). 2024 Aug.
2.Wang L, Tang Y, Tang J, Liu X, Zi S, Li S, Chen H, Liu A, Huang W, Xie J, Liu L, Chao J, Qiu H. Endothelial cell-derived extracellular vesicles expressing surface VCAM1 promote sepsis-related acute lung injury by targeting and reprogramming monocytes. J Extracell Vesicles. 2024 Mar.
END
