本研究通过使用器官型肿瘤球体 (PDOT) 和肝细胞癌（HCC）小鼠模型研究了安罗替尼和抗PD-1疗法的联合作用。为深入研究疗效变化的机制，研究人员对来自HCC小鼠模型的原位肿瘤进行质谱流式细胞术 (CyTOF) 分析，最后使用HCC患者的组织样本和临床数据进行进一步证实，最终得出研究结论：安罗替尼通过PI3K/AKT/HIF-α通路抑制TFRC表达，上调CXCL14基因，将CD8+ T细胞募集到TME，从而提高抗PD-1治疗的疗效；TFRC是评估晚期HCC患者预后、预测抗PD-1治疗疗效的潜在生物标志物。
图1 文章机制图
接下来咱们依次剖析一下从主要研究内容中拓展出的问题，学习下干湿结合研究的“公式”，从而将其应用到实验设计与标书撰写中。
免疫检查点阻断(ICB)疗法是多种癌症包括肝细胞癌（HCC）在内的有效治疗方法，但HCC患者对PD-1/PD-L1抗体治疗的总体反应率仍然不是特别高，且由于原发性或获得性ICB耐药性，很少有患者实现完全治愈。因此，探索新的联合治疗方法至关重要。
1、安罗替尼增强PD-1阻断的抗肿瘤活性：研究人员通过免疫荧光显微镜和流式细胞术进行实验验证，结果显示安罗替尼与抗PD-1抗体之间的协同作用显著增强了肿瘤抑制，超过了单独疗法的效果；使用联合药物指数（CDI）方法评估表明药物间存在协同作用；进一步在HCC小鼠模型中检验联合治疗的疗效，联合治疗方案显示出更有效的肿瘤生长抑制作用。TUNEL染色实验表明，单药治疗组的凋亡细胞显著增加，联合治疗组的TUNEL阳性细胞百分比最高。
图2 安罗替尼在体内和体外增强 PD-1 阻断的抗肿瘤活性
2、PD-1 阻断与安罗替尼联合治疗促进CD8+ T 细胞浸润增加：研究人员采用 CyTOF 检查不同治疗组的肿瘤标本，将免疫细胞分为49个簇，进一步采用无监督聚类方法将这些簇分为10个免疫细胞群，结果显示联合治疗组的T细胞计数显著增加。随后，研究人员采用免疫组织化学方法验证各组T细胞的浸润情况，联合治疗组的T细胞浸润水平显著升高，表示安罗替尼和抗PD-1抗体联合治疗以依赖T细胞浸润的方式抑制肿瘤细胞增殖。
图3 安罗替尼在调节肿瘤免疫中起着至关重要的作用
3、安罗替尼诱导免疫信号并促进促炎细胞因子的产生：研究人员对HCC小鼠模型进行转录组分析，结果显示联合治疗导致基因表达谱发生显著变化。进行GO/KEGG/基因集富集分析 (GSEA) 显示免疫和炎症反应相关通路显著聚集，进一步采用两种不同的免疫信息学算法（mMCP-counter 和 ssGSEA）评估不同组间TME的变化，研究人员发现安罗替尼治疗后与CD8+T细胞浸润相关的基因显著增加；多色免疫荧光及流式细胞术分析证实安罗替尼治疗后CD8+ T细胞PD-1表达显著增强。
图4 安罗替尼触发免疫反应信号并诱导促炎细胞因子和趋化因子的产生
6、 对TFRC敲低的小鼠肿瘤进行免疫组织化学分析显示：安罗替尼抑制TFRC表达并诱导HCC细胞分泌CXCL14，促进CD8+ T细胞浸润到TME。
图5-6 安罗替尼靶向VEGFR2/AKT/HIF-1α轴调节免疫反应
免疫组织化学染色结果显示TFRC低表达的患者CXCL14 高表达，并且有更多的CD8+ T细胞浸润。进一步结合TCGA 数据库与GEO数据库分析发现，TFRC表达较低的HCC患者的预后（总体生存率）明显优于TFRC表达较高的患者，即低TFRC表达与HCC更好的预后和对抗 PD-1 治疗更好的反应相关。
图7 TFRC与HCC患者的总体生存率和对抗PD-1免疫疗法的反应相关
本研究创新点：使用PDOT模型来评估免疫治疗药物的疗效，该模型模拟了肿瘤免疫微环境，这一新模型可以提高免疫肿瘤学研究的精准度，促进更有效疗法的开发。研究也存在局限性：
1、临床前模型中证明了安罗替尼与抗 PD-1 治疗相结合的疗效，但还需要通过广泛的前瞻性随机对照试验进一步验证；
2、抗PD-1抗体与其他TKI的协同效应需要进一步研究；
3、应评估联合疗法的潜在毒性和脱靶效应；
4、需进一步研究TFRC调节CXCL14的具体机制，阐明CXCL14表达背后的调节机制。
总体来讲，本研究和我们之前解读的文章一样，都是经典分子的创新研究。只要大家学会“干湿结合”创新公式，以后再也不用担心本子被评审专家吐槽没新意了！
