IBD青年科研小组出品 | FOXP3+促炎性T细胞：克罗恩病的潜在治疗靶点

IBD青年科研小组——肠道免疫版块

1. 通过分离CD4⁺ T细胞，研究人员能够深度解析与克罗恩病相关的独特细胞类型的转录组特征；

2. 特别指出了一种具有促炎性TNF-α反应基因特征的FOXP3⁺T淋巴细胞。这种细胞类型可能在CD的病理过程中起到关键作用，它们的基因表达特征可能对治疗策略的开发具有重要意义。

从CD患者以及年龄和性别匹配的健康个体中提取回肠活检组织。纯化CD4⁺细胞用于后续的scRNA-seq（图1A）。从健康受试者和CD患者中分别分离出11,520个CD4⁺T细胞和8686个CD4⁺细胞的单细胞转录组，基于已知标记基因的表达，将细胞划分到不同的细胞群（图1B）。聚类分析揭示了8种细胞类型的存在，包括Th17、Th1、调节性T细胞（Tregs）、效应记忆细胞、中央记忆细胞、滤泡辅助T细胞、少量CD4^low细胞和无法分配到特定细胞类型的细胞（"未知"）。确定了健康和CD样本中每个群体的总细胞数（图1C），以及每个样本的细胞组成。值得注意的是，与健康对照组相比，CD患者的Treg细胞比例升高（17.7% vs. S 11.1%；P<0.0001）。同样，从CD患者分离的细胞中Th17（24.1% vs. 21.3%；P<0.0001）和Th1细胞（3.6% vs. 2.1%；P<0.0001）的相对数量也增加。此外，CD患者滤泡辅助T细胞（21.8% vs. 27.7%；P<0.0001）和效应记忆细胞（4.3% vs. 8.9%；P<0.0001）比例降低。主成分分析结果显示，细胞表型（特定符号颜色）在健康对照组（圆圈）中聚类良好，在某些情况下与来自CD患者（三角形，即Th17细胞、Treg细胞和中央记忆细胞）的类似细胞表型（符号颜色）明显不同（图1D）。作为一个群体，中央记忆细胞群与其他效应细胞群分开聚类。为了评估这些观察结果背后的基因表达变化，研究人员按细胞类型识别了CD中相比对照组上调的基因。如预期，炎症相关基因（包括细胞因子和组织相容性抗原编码因子）上调（图1E）。此外，CD中诱导了几种细胞类型特异性标志物，如Treg细胞中的FOXP3和记忆细胞中的SELL。总之，这些数据代表了首次对驱动慢性回肠炎症的CD4+细胞进行的深入转录评估。

图1  scRNA-seq揭示CD患者的细胞动力学

鉴于CD患者Treg细胞数量的增加，以及基于研究人员最近在IBD中BMI1依赖的Treg细胞的发现，本研究更详细地分析了表达Treg细胞标记基因FOXP3的细胞。这些细胞如预期设想的主要存在于先前定义的Treg细胞簇中（图2A）。为确认Treg细胞的身份，将其表达模式与公开的数据集中Treg细胞进行比较，结果显示出显著重叠。FOXP3+细胞的重新聚类表明从健康个体分离的细胞与CD患者的细胞存在明显不同（图2B）。在整个Treg细胞群体中，来自CD患者的细胞（66.4%，1044个细胞）多于对照（33.6%，529个细胞）。根据基因表达谱，Treg细胞被分为5个不同的亚群（图2C）。健康对照组中Treg细胞主要被分配到簇1（健康：351个细胞，66.3%；CD：25个细胞，2.4%），簇2细胞高度异质（健康：110个细胞，20.8%；CD：313个细胞，30.0%），簇3主要包含CD Treg细胞（健康：21个细胞，4.0%；CD：617个细胞，59.1%）。总的来说，簇4和簇5包含较少的细胞数量，簇4比例相似，簇5几乎完全由CD Treg细胞组成。Treg细胞簇1-4高度异质且包含两种性别的细胞，簇5主要由1名特定的CD患者主导。识别独特的转录组特征，确定差异表达最显著的基因（图2D和E）。发现与CD相关的簇3显示出炎症相关基因（TNFRSF4、TNFRSF18、CTLA4和TYMP）的诱导。此外，发现几个热休克蛋白（HSP）编码基因差异表达。可诱导变体HSP90AA1在健康簇1中上调，而组成型HSP90AB1在两种条件下表达相似。为评估潜在的性别相关差异，研究人员分别分析了从女性和男性个体中分离的细胞，仅检测到微小差异。总之，研究人员的分析揭示了CD患者中存在具有活性炎症通路转录标记的不同Treg细胞亚群。

图2 识别CD患者中独特的Treg细胞亚群

考虑到细胞可能在疾病发展和进展过程中经历全转录组变化，研究人员利用拟时序分析方法研究了Treg细胞群体相对基因的表达变化。此计算分析工具推测细胞在时间相关的谱系进程中的排序。与Treg细胞在慢性肠道炎症过程中表现出转录组变化的假设相一致，簇1中的健康Treg细胞以及簇2中的混合群体被预测为拟时间发展的起源（图3A和B）。细胞被预测会经历基因表达变化，这些变化由在簇2（异质性群体）中检测到的细胞所代表，然后转向两种命运之一：簇4（异质）或簇3（主要为CD Treg细胞）。一小部分细胞（簇5；CD）从簇3中分化。拟时间发展过程中显著调控基因的表达模式揭示了各种细胞因子、细胞因子受体和核因子-κB（NF-κB）成员的诱导（图3C）。随后，部分显著差异调控基因的表达模式被可视化，展示了不同亚群间的转录组差异（图3D）。这些发现似乎与健康个体和CD患者的性别无关。

图3 健康状态下的Treg细胞在CD中发展为不同Treg亚群的轨迹

为了识别与疾病相关的Treg细胞中基因表达变化有关的信号网络，研究人员进行了通路富集分析。分析表明，从CD患者中分离的Treg细胞基因表达谱与通过激活B细胞的NF-κB轻链增强子介导的TNF-α信号转导相关的转录组变化高度重叠（图4A）。CellChat分析进一步支持了这一发现，该程序通过受体和配体的表达模式预测细胞间的通信模式。Treg细胞是数据集中唯一被预测为TNF-α信号网络强接收者的细胞群体（图4B–D）。研究人员还分析了公开可用的微阵列分析数据集，其中人来源的Treg细胞在体外用TNF-α处理2或24小时，并与未处理的对照细胞进行比较（GSE18893）。当研究人员将数据集中的差异表达基因与微阵列结果进行比较时，观察到了显著的重叠（图4E）。随后研究人员通过重叠Treg细胞与其他所有细胞群体相比上调的基因与CD中的Tregs与健康Tregs相比上调的基因，鉴定了在CD中诱导的Treg细胞特异性基因（TRICs）（图4F）。获得了一个包含10个基因的列表：BATF、GADD45A、DUSP4、IL2RA、ARID5B、CTLA4、FOXP3、S100A4、TNFRSF18和TNFRSF4。为了观察这些基因在体外的表达变化，研究人员从健康个体中分离CD45RA⁺初始T细胞并将其分化为Treg细胞（图4G）。在分化后，使用TNF-α和其他细胞因子组合处理Treg细胞。值得注意的是，在单独或组合TNF-α、IL12和IL21处理Treg细胞后，观察到大多数CD特异性Treg细胞TRICs的诱导（图4H）。这些发现证实了从CD患者中分离的Treg细胞中差异表达基因对TNF-α的响应性，并支持在CD中Treg细胞是TNF-α信号通路强接收者的生物信息学解释。

图4 从CD患者中分离的Treg细胞对TNF-α信号表现出独特的响应性

在体外模拟了TRIC表达模式的诱导之后，研究人员评估了单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，以确定一种治疗策略来减少这组基因的表达。为此，研究人员使用了ASGARD，这是一个从包含21,304种FDA批准化合物的数据库中识别候选药物的工具。在此过程中，研究人员选择了那些被预测能够显著逆转CD Treg细胞（与对照Treg细胞相比）基因表达模式的药物。这个工具识别出了组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂伏立诺他（Vorinostat）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂坦罗莫司（Temsirolimus）作为潜在的治疗药物（图5A）。实际上，TNF-α-和NF-κB信号通路在CD Treg细胞中上调，并且预测提示Vorinostat和Temsirolimus可影响这2条信号通路。（图5B）。研究人员比较了从CD患者中分离的Treg细胞中上调的基因与从Treg特异性Hdac1或Hdac2缺失的小鼠中分离的Treg细胞的基因表达谱（GSE139480）。研究人员猜想如果CD Treg差异表达基因集在很大程度上依赖于HDAC活性，那么应该能在基因集中找到Treg特异性、HDAC依赖基因的富集。因此，研究人员生成了包含所有在Foxp3-Cre，Hdac1^fl/fl或Hdac2^fl/fl小鼠来源的Treg细胞中下调的基因集，并使用本研究数据集进行了基因集富集分析（GSEA）。结果显示HDAC依赖的基因在CD Treg细胞中显著富集（图5C和D），包括TRICs，如Ctla4、Tnfrsf4和S100a4。基于体外细胞因子筛选的结果，研究人员随后将治疗重点放在那些能够可靠的诱导TRICs（CD特异性Treg细胞基因）表达上调的细胞因子上。在通过TNF-α、IL-12和IL-21诱导与炎症相关的基因表达模式后，使用Vorinostat（图5E）、Temsirolimus或二甲基亚砜（作为阴性对照）处理细胞。正如预期，经过细胞因子处理后，TRICs的水平被诱导上调，特别是在单独添加TNF-α之后。Temsirolimus治疗只影响了一部分TRICs，然而Vorinostat却显著的降低了该类基因表达。总之，研究人员证明在慢性回肠炎症期间，独特的Treg群集与健康Treg不同，并且这些促炎症基因途径高度依赖于HDAC，可以通过Vorinostat进行靶向治疗。

图5  CD患者中的Treg细胞可以通过Vorinostat进行靶向治疗

为了评估暴露于TNF-α和/或Vorinostat后Treg细胞的抑制活性，研究人员进行了体外抑制试验。与未处理的对照细胞相比，TNF-α处理的Treg细胞抑制CD4⁺CD25^-T效应细胞增殖的能力降低，加用Vorinostat处理可恢复TNF-α处理的Treg细胞的抑制能力（图6A）。为了进一步探究Treg细胞对肠上皮细胞的影响，将Treg细胞与人结肠类器官共培养。结果显示与TNF-α处理的Treg细胞共培养的人结肠类器官紧密连接和增殖能力丧失（图6B），当加用Vorinostat处理时可逆转上述现象。同样，MKI67、MLKL2、RIPK3和LGR5的基因表达模式在加入Vorinostat后得到了恢复（图6C）。最后分析了这些共培养的上清液中细胞因子的表达。与之前的发现一致，将FOXP3⁺T细胞暴露于TNF-α导致广泛的调控失常，而加用Vorinostat处理能够使细胞因子水平正常化（图6D）。通过使用标准的（体外抑制实验）和新颖的（类器官共培养系统）功能检测方法，研究人员首次展示了TNF-α暴露的Treg细胞的病理生理作用、可能的责任基因通路以及有前景的治疗途径。

图6  Vorinostat在体外实验中恢复了炎症性FOXP3⁺T细胞的抑制功能

研究人员描述了CD患者中一种新的促炎性FOXP3⁺T细胞亚群，是TNF-α信号的强接受者。通过建立体外模型，发现TNF-α处理的Treg细胞免疫抑制能力减弱，并降低了上皮细胞中对促进黏膜愈合至关重要的紧密连接标记物ZO-1的水平。使用Vorinostat处理恢复了TNF-α处理的Treg细胞的抑制能力。基于患者原始资料，研究者开发使用了FDA批准的药物Vorinostat专门针对CD患者的炎症性FOXP3⁺T细胞进行靶向治疗。未来应对肠道FOXP3⁺细胞进行更多和更大规模的研究，以便与患者的人口统计学特征（例如性别和年龄）和临床特征（例如用药情况）进行相关性分析。

IBD是一组慢性、反复发作、经久不愈的肠道炎症性疾病，它严重影响了患者的生活质量，并加重了个人和社会的医疗费用和经济负担。目前对于它的发病机制仍未完全明确，但确定的是在IBD发生发展中，免疫细胞发挥了至关重要的作用。在漫长的临床实践中，我们可以观察到包括生物疗法在内的治疗方案对许多患者有效，但仍有高达30%的患者对初始治疗没有应答，更为棘手的是，这群初始应答的患者在治疗过程中，随着时间点的推移，高达50%以上的患者会逐步失去药物应答，出现继发失应答。因此，研究IBD的具体发病机制，寻找新的治疗靶点，制定个体化、精准化的治疗方案迫在眉睫。

既往研究表明CD患者肠黏膜固有层内CD4⁺ T细胞经体外活化刺激后产生大量Th1/Th17效应相关的促炎症细胞因子（如TNF、IFN-γ、IL-17A）；而UC患者肠黏膜固有层内CD4⁺ T细胞可分泌大量Th2效应相关的炎症因子（如IL-4、IL-13），以及Th17相关的促炎症细胞因子（IL-17A）。除此之外，调节性T细胞也发挥了重要的作用。

在本项研究中，研究者通过单细胞测序技术识别出了独特的5种调节性T细胞亚群，并且它们对TNF-α信号存在特殊响应性。研究者还使用工具分析识别出了组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂伏立诺他（Vorinostat），在体外实验中，TNF-α处理的Treg细胞抑制CD4⁺CD25^-T效应细胞增殖能力降低，而Vorinostat可恢复TNF-α处理的Treg细胞的抑制功能，这也将是未来治疗CD的一个潜在新靶点。但本项研究也存在一些局限性，如研究中只采用了体外细胞培养和类器官培养的模拟实验，缺乏体内模型或临床研究的进一步直接验证，且在机制探讨方面仍可继续深入解析。

总结来说，本研究筛选出了一群新的调节性T细胞亚群，并寻找到了潜在的新的CD治疗靶点，为IBD患者的精准靶向治疗提供了重要的理论依据。