四川大学华西医院风湿免疫科赵毅团队联合四川大学分析测试中心吴鹏团队于2024年9月在Biosensors and Bioelectronics发表文章“Improved diagnosis of systemic lupus erythematosus with human-derived double-stranded DNA antigen”（点击二维码阅读原文）。本研究利用人源的dsDNA作为抗dsDNA抗体的捕获抗原，构建了一种检测抗dsDNA抗体的新型荧光免疫方法。因人源dsDNA抗原对病原抗dsDNA抗体具有一定选择性，对540个临床样本分析后，发现新方法诊断SLE的性能优于现有的基于绿蝇短膜虫基质的间接免疫荧光法和化学发光免疫检测。
系统性红斑狼疮（SLE）是一种累及多系统多器官、难以根治的自身免疫性疾病，其发病率0.02-0.15%。抗dsDNA抗体是SLE的重要血清学标志物。目前，基于绿蝇短膜虫基质的间接免疫荧光法（CL-IFT）和化学发光免疫检测（CIA）是SLE临床诊断的主要方法，但均难以兼顾高灵敏度和高特异性（图1A）[1]。部分原因是由于捕获抗dsDNA抗体的dsDNA抗原来源和质量存在差异（如种属差异、存在ssDNA区域等），易受非病原dsDNA抗体（源于感染）和抗ssDNA抗体的干扰[2-3]，致使诊断SLE的准确度难以提高，且时常存在争议性的检测结果。有研究表明，人源dsDNA能够选择性结合病原抗dsDNA抗体（图1B）[4]，进而避免非病原抗dsDNA抗体干扰。因此，将人类基因组DNA作为抗dsDNA抗体的捕获抗原，有望提高SLE诊断的灵敏度和特异性。
图1 抗dsDNA检测存在的问题及新型免疫荧光分析方法（IFA）构建思路
研究团队以人类基因组DNA为模版，通过PCR合成了长度和序列均一、结构完整的人源dsDNA（>1000 bp，图1C），并通过链霉亲和素和生物素之间的高亲和力将人源dsDNA固载于磁珠上，构建了一种基于“三明治”结构的新型免疫荧光分析方法（IFA）。以世界卫生组织的标准品（15/174）为基准物质，分析结果显示IFA的方法灵敏度高于临床的CL-IFT和CIA，主要原因是IFA有效避免了非病原dsDNA抗体和抗ssDNA抗体对检测结果的干扰。在520例临床血清样本分析中，IFA诊断的准确度为71.9%，优于临床的CL-IFT（68.8%）和CIA（65.3%）。此外，IFA的结果与SLE的疾病活动性（SLEDAI-2000）、肾脏受累和SLE的预后也具有较高的相关性，表明IFA可作为一种监测SLE活动度的工具。因IFA的分析过程简单、易于实现自动化分析、且具备较高的稳定性和准确度，它在抗dsDNA抗体检测的方法标准化方面具有潜在的应用前景。
图2 临床样本验证IFA诊断SLE的准确度
图3 抗dsDNA检测结果与SLE活动度的相关性研究
在构建方法时，研究团队首先从结构模拟和实验验证两个方面探究了dsDNA抗原序列对抗dsDNA抗体亲合力的影响，并通过凝胶电泳、荧光和Zeta电位对方法的构建过程进行了详细验证。在优化了IFA相应实验参数后，用世界卫生组织的标准品（15/174）对方法的灵敏度进行了测试和比较。最后，利用520例临床血清样本，评价了新IFA诊断SLE的准确度和监测SLE活动度的应用潜力。
总之，本研究将人源dsDNA作为抗dsDNA抗体的捕获抗原，避免了非病原抗dsDNA抗体和抗ssDNA抗体的影响，进而提高了新建IFA诊断SLE的准确度和活动度监测的相关性。因检测的抗dsDNA与SLE活动度具有较好的相关性，IFA也可作为SLE活动度监测的一种新手段。
专家点评
李梦涛教授：抗dsDNA抗体是SLE的一个重要标志物，对于SLE的诊断和病情评估具有重要的指导意义。目前临床上检测抗dsDNA抗体的方法主要依赖以基于绿蝇短膜虫基质的间接免疫荧光法（CL-IFT）和化学发光法（CIA）。然而，对于CL-IFT而言，其特异性较高，但灵敏度低，也无法定量分析；而CIA虽然灵敏度高、能够定量，但特异性相对较低，甚至不同批次试剂会导致检测结果不一致，这些客观问题给SLE的临床诊断和病情评估带了诸多不便和困惑。
四川大学华西医院风湿免疫科赵毅团队联合四川大学分析测试中心吴鹏团队，通过对临床问题的深入剖析，发现dsDNA抗原在对抗dsDNA抗体的检测具有重要影响。因此，该团队以人类基因组DNA为模版，利用PCR合成了长片段的人源dsDNA抗原，避免了非病原抗dsDNA抗体和抗ssDNA抗体的干扰。随后，以磁珠作为固载相，成功构建了一种检测抗dsDNA抗体的新型IFA方法。研究表明，与临床的CL-IFT和CIA相比，新建的IFA检测抗dsDNA抗体在SLE诊断中表现出了更高的准确度，且结果与SLE的活度相关性更高。该研究成果为SLE的诊断和活动度监测提供了一种新手段，对促进抗dsDNA抗体检测方法的标准化具有重要意义。
李梦涛，北京协和医院风湿免疫科主任，教授、博士生/博士后导师，协和学者特聘教授，国家卫生健康突出贡献中青年专家，北京医学会风湿病学分会主任委员，中华医学会风湿病学分会副主任委员，中国医师协会风湿免疫科医师分会副会长兼肺血管/间质病学组组长，亚太抗风湿病联盟（APLAR）系统性红斑狼疮研究组成员，中国系统性红斑狼疮研究协作组（CSTAR）、风湿免疫病学教育部重点实验室主任，Rheumatology and Immunology Research (RIR) 副主编，系统性红斑狼疮研究国家十四五重点研发计划项目首席，代表团队在国际会议发言33次，以第一/通讯作者发表SCI论文111篇，荣获CRA/EAGOR/APLAR/EULAR青年研究者奖。
作者心得
在临床上，抗dsDNA抗体检测结果不一致现象经常出现在不同检测方法之间，甚至相同方法的不同批次试剂盒之间也存在差异。在2013年，杜克大学的Pisetsky教授在Immunologic Research上公开呼吁需将抗dsDNA抗体的测定方法标准化，但时至今日抗dsDNA抗体检测仍然没有较好的标准方法可供参考。通过查阅大量的文献和对现有检测方法的分析，研究团队发现，在检测抗dsDNA抗体过程中，非病原dsDNA抗体（感染诱导产生）和抗ssDNA抗体可能会影响检测结果，而利用结构完整的人源dsDNA作为捕获抗原可能解决上述问题。基于此，我们利用PCR获得了完整的长片段人源dsDNA抗原，并以此构建了新型IFA检测方法。该方法的临床样本分析结果基本符合实验预期。
在投稿方面，我们先后选择多种杂志进行投稿，有部分审稿人对本工作给与了高度评价，但因所有审稿人未达成共识，未能成功发表。随后，我们将稿件投至Biosensors & Bioelectronics，一审耗时约2个月。2位审稿人对于解决的问题高度认可，并对合成dsDNA抗原的验证和一些实验细节给与了改进建议，3周内完成修改并提交。随后，一个审稿人对dsDNA的验证提出了新建议，我们补充了相关数据，进而了第二次修回，2周后论文接收。在前期投稿中，可能由于文章的交叉学科背景，审稿人对稿件的评价分歧较大。后期投稿过程中，我们对文章的用语进行了修改，让整个文章更好理解，送审和修改过程较为顺利。
通信作者
赵毅，主任医师，医学博士，博士生导师/博士后合作导师，四川大学华西医院风湿免疫科副主任，四川省免疫炎症疾病精准防治示范性国际科技合作基地负责人。四川省学术和技术带头人，中华医学会风湿病学分会青年委员会副主任委员，中国医师协会风湿免疫科医师分会青年委员会副主委，四川省医学会风湿病学专业委员会侯任主委。国家重点研发计划政府间国际科技创新合作重点专项项目负责人，主持国家自然科学基金3项，四川省科技计划项目4项，获授权发明专利4项。以通讯作者（含共同）在Signal Transduct Target Ther. 、Proc Natl Acad Sci U S A. 、Biosens Bioelectron. 等国际高质量期刊发表临床和基础研究工作。受邀作为分会主席主持欧洲抗风湿病联盟（EULAR）年会。
共同通信作者
吴鹏，四川大学分析测试中心/化学学院教授，博导，国家杰青（2023）/国家优青（2015），四川省学术与技术带头人（2021）。近年来的研究工作以室温磷光的光物理和光化学调控为基础，探究其在分析化学领域的新应用。已在Nat Commun. 、Angew Chem Int Ed Engl.、Adv Mater. 、CCS Chem. 、Anal Chem. 等国际知名期刊上发表论文100余篇，H-index 35。
第一作者
李显明，四川大学华西医院风湿免疫科博士后，助理研究员，主要聚焦于免疫疾病诊断、病原微生物检测相关的新方法研究。主持国家自然科学基金青年项目、四川省科技厅青年基金、国家博士后科学基金面上项目等多个项目，以第一作者/共同一作/共同通讯在Anal Chem. 、Biosens Bioelectron. 、ACS Sens. 、Food Chem. 等期刊发表SCI论文多篇。
共同第一作者
唐鸿鹄，四川大学华西医院风湿免疫科，主治医师，医学博士，主要从事风湿免疫常见病及罕见病的临床与机制研究，主持两项省级课题，参与一项国家级重点研发计划及两项国家自然基金，参编教材及专著3部。
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编辑：姜维嘉
排版：张洪雪
华西期刊社简介
四川大学华西医院华西期刊社成立于2006年，出版有14种医学科技期刊（9种中文和5种英文），其中SCI收录期刊2种，ESCI收录期刊2种，EI收录期刊1种、MEDLINE收录期刊4种、CSCD收录期刊7种、北大中文核心期刊要目总览收录期刊5种。华西期刊屡获“中国出版政府奖期刊奖”、“中国百种杰出学术期刊”、“中国精品科技期刊”、“中国最具国际影响力学术期刊”等殊荣。1种期刊入选“中国科技期刊卓越行动计划——领军期刊”项目，2种期刊入选“中国科技期刊国际影响力提升计划——D类（现：中国科技期刊卓越行动计划——高起点新刊）”项目。在国家双一流建设背景下华西期刊社加快推进英文期刊建设，目前已与Nature、Wiley-Blackwell、Oxford University Press、BMC等国际一流出版集团建立了合作关系。
