四川大学华西医院干细胞与组织工程研究中心/骨研所/生物治疗全国重点实验室解慧琪研究员团队于2024年10月在Biomaterials发表文章“Exosomes from Hypoxic Urine-derived Stem Cells Facilitate Healing of Diabetic Wound by Targeting SERPINE1 through miR-486-5p”（点击二维码阅读原文）。本研究通过低氧预处理尿源性干细胞，上调其外泌体中miR-486-5p表达，并靶向SERPINE1增强成血管潜能。同时负载在改性猪小肠黏膜下层水凝胶中，协同加速糖尿病创面中的血管生成、胶原沉积和再上皮化，有效促进了创面愈合。
中国每年有超过300万例糖尿病足溃疡新病例，导致超过28万例下肢截肢。糖尿病患者常见的微血管病变和大血管疾病导致血流量减少，降低了氧气和营养物质的供应，从而导致难愈慢性创面的产生。近年来，以间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）为基础的治疗在糖尿病创面修复方面显示出了巨大的应用前景。其中旁分泌作用参与了MSCs治疗多种疾病的潜在作用机制，而外泌体在这一过程中发挥重要作用。
但自然产生的外泌体疗效有限，且极易降解，无法满足糖尿病创面这种病理环境复杂且需要长期护理的疾病过程。课题组前期研究表明，低氧预处理的尿源性干细胞（urine-derived stem cells, USCs）在创面愈合早期血管化以及胶原的合成过程中发挥着突出的效果，而这种效果取决于干细胞旁分泌作用的增强。此外，外泌体的低保留率和体内不稳定性也是阻碍其治疗效果的另一个重要因素，为了提高其保留率/增强其稳定性，研究人员开发了多种凝胶体系。其中，细胞外基质水凝胶因其的成分和结构类似于自然的胞外基质，且具有良好的生物相容性和组织活性，可以作为一种理想的载体，用于外泌体的负载和释放。团队先前的研究证明，细胞外基质材料—猪小肠黏膜下层（small intestinal submucosa, SIS）含有丰富的生物活性因子，可以有效地促进新组织的生长和伤口的愈合，且其富含各类官能团便于化学改性。
图1 装载低氧外泌体的细胞外基质水凝胶用于糖尿病创面修复的示意图：低氧外泌体逐渐从水凝胶中释放出来，通过降低炎症、加速血管生成和胶原沉积，从而促进组织修复。在机制方面，低氧USCs的外泌体与HUVECs相互作用时，可以增强成管相关基因的表达。此外，低氧外泌体中miR-486-5p水平的升高可以通过特异性调控靶基因SERPINE1的表达来加速血管生成。
本研究中，我们通过低氧预处理USCs，增强其外泌体成血管潜能，并将其负载于改性SIS水凝胶（SISMA）中，以缓慢释放外泌体，从而协同促进糖尿病创面的修复（图1）。结果显示，负载低氧诱导USCs外泌体的SISMA水凝胶体外促进了内皮细胞的增殖、迁移和成管。在糖尿病全层皮肤缺损模型中，该复合材料可以通过促进血管化，再上皮化和胶原沉积，显著加速创面愈合（图2）。
图2 负载低氧诱导USCs外泌体的SISMA水凝胶生物学功能评价：（A）常氧/低氧外泌体的透射电镜图片；（B）HUVECs对常氧/低氧外泌体的摄取情况；（C）SM@H-exo增强体外HUVECs的增殖、迁移和成管；（D-E）SM@H-exo促进糖尿病大鼠创面愈合。
为了探讨低氧刺激如何介导外泌体促进组织修复的潜在机制，我们利用miRNA测序技术对外泌体进行了分析。结果显示，低氧条件改变了外泌体内miRNA的功能谱，特别是miR-486-5p的上调，这抑制了内皮细胞中SERPINE1的活性，血管生成增强的机制可能与经典的HIF-1α信号通路的激活有关。体外验证实验也证明，SERPINE1的沉默可以消除miR-486-5p抑制剂对HUVECs迁移和成管产生的不利影响（图3）。
图3 低氧刺激介导外泌体促进血管新生的机制探究：（A-C）外泌体miRNA测序结果；（D-E）双荧光素酶和体外成管挽救实验。
近年来，鉴于MSCs外泌体在安全性和使用便捷性方面占据的优势，为多种疾病治疗开阔了新的思路和方法。本研究选取的USCs是一种来源广泛、可无创获取的MSCs，我们不仅通过低氧预处理增强了其外泌体治疗潜能，还开发了一种新型的细胞外基质水凝胶SISMA用于递送外泌体，解决了外泌体易降解的问题，大大提高了治疗效率。同时，我们首次对常氧/低氧USCs的外泌体进行了全面的miRNA测序，发现了一种促血管生成的新机制，这为未来使用USCs衍生的外泌体治疗糖尿病创面和其他疾病提供了一个潜在的参考。
专家点评
邓君教授：间充质干细胞来源的外泌体有望在糖尿病创面修复中更好促血管新生。解慧琪教授团队创新性地通过低氧预处理USCs增强其衍生外泌体的成血管潜能，将其负载于SIS化学改性的细胞外基质水凝胶中，实现外泌体的高效负载和缓释，协同促进内皮细胞增殖、迁移和成管。在糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型中，SM@H-exo可以通过促进血管化，再上皮化和胶原沉积，显著促进创面高质量修复。此外，作者还通过组学的手段证实低氧外泌体内含有更多的与血管生成和组织修复有关的miRNA，特别是miR-486-5p。体外验证实验也证明，SERPINE1的沉默可以消除miR-486-5p抑制剂对HUVECs迁移和成管产生的不利影响。该研究丰富了我们对于缺氧微环境影响干细胞旁分泌的认识，为基于外泌体用于创面血管新生提供了新思路，并有望拓展至其他组织再生修复领域。
邓君，陆军军医大学第一附属医院全军烧伤研究所副所长、创伤与化学中毒全国重点实验室主任助理，教授、博士生导师。重庆市学术技术带头人（烧伤学科）、国家优青、重庆市杰青、军队高层次科技创新人才、红医名师。从事疾病早期诊断、生物材料与组织再生修复研究。以第一/通讯作者在Advanced Materials、Nature Communications、Science Advances、Nano-Micro Letters 等期刊发表SCI论文50余篇，累计影响因子500+；获国家发明专利5项，主编英文专著1部。主持国家自然基金4项，重点研发计划子课题、军队173重大项目课题等国家和省部级项目10余项；获得“中华医学科技一等奖”1项。
作者心得
本研究选题思路来自课题组前期工作[1]，低氧预处理的USCs复合SIS膜片可通过促进血管化加速糖尿病创面愈合，而这种效果主要是基于细胞的旁分泌作用。基于此，在本研究中，我们探究了来自低氧诱导的USCs外泌体对血管生成的影响。miRNA测序结果显示，低氧条件改变了外泌体内miRNAs的种类，其中miR-486-5p的上调抑制了内皮细胞中SERPINE1的活性，从而促进血管生成，血管生成的机制可能与经典的HIF-1α信号通路的激活有关。此外，我们还开发了一种易于制备和具有良好生物相容性的细胞外基质水凝胶材料SISMA，用于负载和缓释外泌体，对糖尿病创面的愈合产生协同作用。
本研究成果发表于生物材料领域经典TOP期刊Biomaterials，该期刊在生物材料科学、生物医学工程领域具有较高的影响力。投稿之初，考虑到文章的创新点在于促血管生成的新机制以及水凝胶负载外泌体这种新型的给药方式，所以我们选择了药学领域的TOP期刊Acta Pharmaceutica Sinica B，编辑肯定了研究的价值，但是认为研究方向与其期刊主题不符，建议转投。本文在转投Biomaterials后三天内快速送审，两个月后收到两位审稿人的意见。两位审稿人对本研究的创新性和研究价值给予了肯定，并对文章的摘要图示、外泌体作用机制和免疫组化数据等方面提出了共11项修改建议。我们根据审稿人的意见在两个月内认真补充外泌体体内示踪、动物病理染色、体外成管和免疫相关流式细胞术等实验，新增了6张数据图，并逐一回复了每一条审稿意见。其中，对于外泌体在动物体内作用方式的探究，荧光示踪是一个常见的手段，在进行外泌体的体内示踪时，选择合适的外泌体染料是非常重要的，不仅需要考虑标记效率和荧光淬灭的问题，还要考虑组织自发荧光等因素。文章返修后40天被顺利接收。虽然只经历了一轮修订，但从投稿至接收耗时将近五个月，周期较长，等待过程中无需紧张焦虑，保持心态稳定即可。
通信作者
解慧琪，研究员、四川大学二级教授、博士生导师，四川大学华西医院生物治疗全国重点实验室干细胞与组织工程研究中心主任，骨科研究所副所长。“教育部重要人才计划”特聘教授，四川省学术和技术带头人，天府科技领军人才，首届转化医学创新奖获得者，国家重点研发计划项目负责人。长期从事组织工程学研究，致力于组织修复再生及细胞外基质材料研究与转化。主持包括国家重点研发计划、国家自然科学基金等在内的30余项课题，以第一/通讯作者发表学术论文120余篇，主编英文专著1部，参编10余部，获国家发明专利授权30余项。带领团队将研究成果成功转化，获批国家药品监督管理局三类医疗器械产品注册证书5项，另有5项正在进行多中心临床试验。
第一作者
范明慧，四川大学华西医院生物治疗全国重点实验室细胞生物学专业硕士研究生，导师为解慧琪研究员，主要研究方向为软组织再生及修复。目前以第一作者在Biomaterials、Bioact. Mater.上发表论文2篇，参加学术会议6次，获2024中国生物医学工程大会暨创新医疗峰会青年论文竞赛一等奖、第五次组织修复与再生修复学术会议口头报告二等奖等荣誉。
共同第一作者
张秀珍，博士，助理研究员，毕业于四川大学生物治疗全国重点实验室，师从解慧琪教授。主持国家自然科学基金青年基金，中国博士后面上基金，四川省青年科学基金等5项课题。以第一作者和共同第一作者在Sig. Transduct. Target. Ther.、Biomaterials、Bioact. Mater.等期刊发表研究性论文4篇。申请专利4项，其中发明专利和实用新型专利各授权2项。主要研究方向为软组织修复重建。
团队简介
解慧琪研究员团队长期致力于“以临床为导向的ECM材料研究与转化”，围绕制约ECM材料临床应用的关键问题进行攻关，成功建立了关键核心技术体系（高效脱细胞技术、构形优化技术、组织工程构建技术等）。团队共发表高水平论文400余篇，包括Sci. Adv.、Sig. Transduct. Target. Ther.、Biomaterials、Bioact. Mater.等相关专业领域的TOP期刊；获授权专利32项，推动技术成果转化12项，形成了ECM再生修复材料研究及产品开发的转化研究链条。获得国家药品监督管理局三类医疗器械产品注册证书5项，产品覆盖全国30个省市的2000多家综合医院，疗效显著，惠及500余万患者，打造了具有国际竞争核心优势的中国自主生物医用材料品牌，具有良好的社会和经济效益。
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编辑：汪文静
排版：张洪雪
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华西期刊社简介
四川大学华西医院华西期刊社成立于2006年，出版有14种医学科技期刊（9种中文和5种英文），其中SCI收录期刊2种，ESCI收录期刊2种，EI收录期刊1种、MEDLINE收录期刊4种、CSCD收录期刊7种、北大中文核心期刊要目总览收录期刊5种。华西期刊屡获“中国出版政府奖期刊奖”、“中国百种杰出学术期刊”、“中国精品科技期刊”、“中国最具国际影响力学术期刊”等殊荣。1种期刊入选“中国科技期刊卓越行动计划——领军期刊”项目，2种期刊入选“中国科技期刊国际影响力提升计划——D类（现：中国科技期刊卓越行动计划——高起点新刊）”项目。在国家双一流建设背景下华西期刊社加快推进英文期刊建设，目前已与Nature、Wiley-Blackwell、Oxford University Press、BMC等国际一流出版集团建立了合作关系。
