大家好，今天和大家分享一篇发表在ACS Central Science上的题为“Macrophage Inactivation by Small Molecule Wedelolactone via Targeting sEH for the Treatment of LPS-Induced Acute Lung Injury”的文章。本研究发现蟛蜞菊内酯(WED)通过靶向可溶性环氧化物水解酶(sEH)抑制巨噬细胞激活，治疗脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)。WED与sEH的Phe362和Gln384氨基酸相互作用，提高环氧二碳三烯酸(EETs)水平，进而调节GSK3β介导的NF-κB和Nrf2通路，减轻炎症和氧化应激。在ALI动物模型中，WED或sEH敲除减轻肺损伤和炎症。这些发现为通过靶向sEH抑制巨噬细胞活化来治疗ALI提供了更广阔的前景，并表明WED是开发新型sEH抑制剂的潜在药物。
在呼吸系统中，是由病原体、外源性底物如脂多糖（LPS）、颗粒物质引起的被激活的巨噬细胞，都会产生大量的促炎因子，从而导致炎症组织的器官损伤。此外，炎症和氧化应激相互加速损伤。因此，阻断炎症和氧化应激是治疗呼吸系统疾病的重要策略。
蟛蜞菊内酯wedelolactone（WED）是从金盏花中分离得到的一种具有C-3和C-4的苯并呋喃部分的多酚，具有抗炎、抗癌和肝保护以及缓解帕金森病和肾脏损伤的作用。WED在巨噬细胞介导的呼吸系统疾病，特别是急性肺损伤（ALI）中是否存在保护作用及其保护机制和作用靶点尚不清楚。
可溶性环氧化物水解酶（sEH，EPHX2基因编码）是一种环氧脂肪酸代谢的关键酶，广泛分布于肝、肾、脑等众多器官中，可通过调节环氧二碳三烯酸（EETs）和其他环氧脂肪酸（EpFAs）的水平在炎症中起关键作用。该研究发现一种小分子WED靶向sEH并导致巨噬细胞失活，蟛蜞菊内酯靶向sEH治疗急性肺损伤。
作者首先在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中确定了WED的浓度(5、10和20 μM)，如图1A所示，WED在LPS诱导的巨噬细胞中显示出显著的抗炎作用。此外，WED通过NF-κB途径以剂量依赖性方式逆转了lps诱导的炎症基因如TNF-α、iNOS、IL-6、COX-2、单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)和细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)和蛋白如TNF-α、COX-2、iNOS、IL-6和MCP-1的上调。共聚焦显微镜结果支持LPS刺激促进转录因子p65入核的观察，而给予WED，Western blot检测细胞质和细胞核中p65的水平进一步支持。这些结果支持了WED在体外的抗炎作用（图1）。
图1. WED通过NF-κB通路减轻体外炎症反应
其次作者探究发现WED在体内可减轻LPS诱导的ALI小鼠的肺损伤，采用气管内灌注脂多糖构建ALI小鼠模型，研究WED在体内的保护作用。单独的LPS处理增加了肺泡壁厚度和塌陷。此外，研究发现WED治疗显著降低了支气管肺泡灌洗液（BALF）中相关细胞和相关酶的活性（图2）。
图2. WED减轻了LPS诱发的ALI小鼠的ALI病程
紧接着作者为了发现WED的直接细胞靶点，使用环氧激活的琼脂糖珠偶联WED进行靶点垂钓实验。银染色后在约63 kDa处出现了一个独特的蛋白条带，并根据LC-MS/MS分析确定为sEH，这通过使用其相应的抗体通过Western blot进一步验证。同时，免疫荧光共定位分析证明了WED和sEH的直接结合，这一结果得到了免疫沉淀(IP)-MS、细胞热位移分析(CETSA)和药物亲和力反应靶点稳定性(DARTS)结果的支持(图5D-F)。MST和基于荧光的结合试验结果显示，WED和sEH具有出色的结合亲和力，Kd值分别为87.2 nM和68.7 nM。sEH作为c末端具有水解酶活性的功能性蛋白，在AA代谢中起着关键作用；我们发现，WED在酶水平显著抑制了人类和小鼠的sEH活性。此外，WED增强了sEH底物14,15- eet的水平，并降低了其在LPS诱导的巨噬细胞中的二醇水平。14,15- eet和14,15- dhet的比例也反映了在细胞水平上WED的抑制作用。这些结果表明了WED与sEH的直接结合作用（图3）。
图3. sEH是WED抗炎、抗氧化的直接靶点
作者为了确定WED与sEH的结合位点，我们进行了分子动力学模拟。结果显示WED-sEH配合物稳定，结合能强，WED的结合减少了sEH催化腔的体积。模拟中WED与sEH的多个氨基酸残基（包括Phe362和Gln384）形成氢键。通过突变Phe362和Gln384为Ala，我们验证了这两个氨基酸在WED与sEH结合中的关键作用。下拉实验、CETSA和DARTS实验均支持这一结论。在LPS刺激的RAW264.7细胞中，这些突变消除了WED的抗炎和抗氧化作用。因此，Phe362和Gln384是WED与sEH结合的重要位点(图4)。
图4. Phe362和Gln384在WED与sEH的结合中发挥作用
最后作者为了验证WED的肺保护作用是否依赖于sEH靶点，构建了sEH敲除(KO)小鼠。Ephx2基因缺失减轻了LPS诱导的ALI小鼠的肺结构损伤、炎症细胞浸润以及MPO活性、TNF-α和IL-6水平的升高。进一步，WED在sEH KO小鼠中未能提供额外的保护效果，且WED对GSK3β的抑制作用在sEH KO小鼠中也不明显。这些结果表明WED的肺保护作用依赖于sEH靶点（图5）。
图5. sEH基因KO消除了WED的肺保护作用
综上所述，在该研究中，作者发现金盏花活性成分蟛蜞菊内酯 (WED)靶向sEH并导致巨噬细胞失活。在体外实验中，WED通过与氨基酸Phe362和Gln384的分子相互作用，抑制sEH活性，提高EETs水平，从而通过调节糖原合成酶激酶3β (GSK3β)介导的核因子κB (NF-κB)和核因子e2相关因子2 (Nrf2)通路，减轻炎症和氧化应激。在LPS刺激的ALI动物模型中，通过WED或sEH敲除(KO)抑制sEH可减轻肺损伤，如肺泡壁厚度增加和塌陷。此外，WED或sEH基因KO在体内均抑制巨噬细胞活化，减轻炎症和氧化应激。这些发现为通过靶向sEH缓解炎症和氧化应激治疗ALI提供了更广阔的前景，并表明WED是开发新型合成sEH抑制剂的天然先导候选物。
本文作者：ZWT
责任编辑：CT
全文链接：
https://doi.org/10.1021/acscentsci.2c01424
