衰老是一个内在的生物过程，伴随着全身性变化，导致生理完整性受损和对年龄相关疾病的易感性增加。衰老特征包括细胞衰老、基因组不稳定等，衰老细胞（SnCs）通过分泌衰老相关分泌表型（SASP）促进继发性衰老并损害正常组织功能。针对SnCs的治疗主要有消除SnCs和抑制SASP信号传导两类，但各有局限性。新研究表明，特定细胞的衰老可以是动态的，且人胚胎干细胞衍生的外泌体在再生和恢复活力方面显示出潜力。因此，本研究提出了一种名为“Senoreverse”的新策略，旨在逆转SnCs的增殖停滞，以实现逆转衰老。
姬广聚教授团队在Cell Metabolism上发表题为《Exosomal miR-302b rejuvenates aging mice by reversing the proliferative arrest of senescent cells》的文章，该研究结果证实hESC Exos通过在体外恢复SnC的增殖能力来逆转衰老，为缓解衰老及衰老相关病理提供了一种方法。
1. hESC-Exos使衰老IMR-90细胞年轻化
研究表明，衰老的人成纤维细胞系 IMR-90经PDL50、hESC-Exos后，细胞的衰老表型显著改善。经过 72 h的hESC-Exos 处理，观察到衰老相关 β-半乳糖苷酶活性降低，衰老和 SASP 相关基因表达下调，细胞增殖显著促进，增殖标志物 Ki67 表达增加，S 期细胞比例升高。RNA 测序结果显示，hESC-Exos 显著抑制衰老相关基因（如 TP53、IL-6、CDKN1A 和 CDKN2A）的表达，同时增强增殖相关基因（如 MKI67、PCNA、TOP2A 和 CDK1）的表达。基因集富集分析进一步表明，hESC-Exos 处理增强了细胞周期相关的富集，表明其能够恢复衰老细胞的活力并重塑增殖潜力。
图1.hESC-Exos使衰老的IMR-90细胞恢复活力
2. hESC-Exos在单细胞分辨率下逆转了SnC的增殖停滞。
通过在CDKN1A基因下游插入黄色荧光蛋白（YFP）基因，观察到在阿霉素（Dox）处理下，SnC的衰老状态表现出增强的YFP信号和SA-b-gal活性。流式细胞术（FCM）分析显示，hESC-Exos处理能够抑制Dox诱导的衰老，并使部分SnC重新进入增殖周期。scRNA-seq结果表明，hESC-Exos处理增加了年轻化细胞（Rej）的比例，降低了衰老细胞（Sen）的比例，且与细胞周期相关的基因表达发生变化。因此，hESC-Exos治疗能够逆转SnC的增殖停滞，恢复其增殖能力。
图2.hESC-Exos在单细胞分辨率下逆转SnC的增殖阻滞
3. hESC-Exos 治疗使衰老小鼠恢复活力
首先确认hESC-Exos的安全性，随后发现其治疗显著延长了衰老小鼠的寿命，并改善了与衰老相关的表型，如减少白发和膀胱过度活动。行为测试显示，hESC-Exos小鼠在运动和记忆方面表现优于对照组，且促炎细胞因子的水平显著降低。此外，hESC-Exos治疗逆转了衰老组织中的衰老细胞积累，减少了DNA损伤标志物的表达，并改善了组织的病理特征。总体而言，hESC-Exos治疗有效逆转了小鼠的衰老表型。
图3.hESC-Exos治疗使衰老小鼠恢复活力
4. hESC-Exos 治疗重塑了衰老小鼠的增殖过程
通过对衰老小鼠的肝脏和皮肤组织进行单细胞RNA测序，发现hESC-Exos处理能够重塑细胞类型组成并逆转与年龄相关的基因表达变化。分析显示，hESC-Exos治疗恢复了S期细胞的比例，并识别出与细胞周期相关的救援基因（CCGs），如Cdkn1a和Ccng2，这些基因在衰老过程中表达上调。进一步的免疫荧光染色证实了hESC-Exos处理抑制了这些基因的表达，进而促进了细胞周期的恢复和年轻化。总之，hESC-Exos处理部分恢复了衰老小鼠的增殖相关特征。
图4.hESC-Exos治疗重塑衰老小鼠的增殖过程
5.在hESC-Exos抑制的细胞周期检查点Cdkn1a和Ccng2中富集miR-302b
高通量测序和绝对定量PCR分析显示，miR-302b在hESC-Exos中富集，并与细胞增殖和衰老相关的靶基因Cdkn1a和Ccng2存在调节关系。通过双荧光素酶测定验证了miR-302b对这两个基因的靶向作用。与衰老对照小鼠相比，衰老外显子小鼠的肝脏和皮肤组织中miR-302b水平显著降低，伴随Cdkn1a和Ccng2表达的减少。进一步实验表明，miR-302b的过表达能够改善细胞的年轻化特征，抑制衰老相关标志物的表达，促进细胞周期的恢复。总体而言，miR-302b通过抑制Cdkn1a和Ccng2的表达，发挥了促进细胞年轻化的作用。
图5.在hESC-Exos抑制的细胞周期检查点Cdkn1a和Ccng2中富集miR-302b
6.miR-302b 治疗恢复活力的衰老小鼠
通过电转染293F细胞外泌体，生成了富含miR-302b的Exos-302b，并将其施用于25月龄的衰老小鼠。结果显示，miR-302b的递送促进了小鼠的毛发生长、体重增加和认知能力提升，尤其在握力和水迷宫测试中表现明显改善。此外，miR-302b的施用减轻了小鼠体内的慢性炎症，逆转了衰老组织中衰老细胞的积累，降低了DNA损伤标志物g-H2AX的表达，并提高了与基因组稳定性相关的标志物H3K9me3的水平。组织分析显示，衰老302b小鼠的肝脏、皮肤和大脑中miR-302b的含量显著升高，同时抑制了Cdkn1a和Ccng2的表达。总体而言，miR-302b通过抑制衰老相关基因的表达，恢复了细胞的增殖能力，促进了小鼠的年轻化。
图6.miR-302b治疗恢复活力的衰老小鼠
7.长期的miR-302b递送减缓了衰老过程，没有引起安全问题
探讨miR-302b对衰老小鼠的影响。结果表明，miR-302b的递送能显著减轻与衰老相关的体重减轻，并延长小鼠的中位寿命137天，死亡风险降低38%。尽管雄性和雌性小鼠之间的死亡风险没有显著差异，雄性小鼠的寿命延长更为明显。递送miR-302b改善了小鼠的外观，增加了背毛覆盖率，减少了脊柱弯曲，同时未增加肿瘤或疾病负担。病理分析显示，miR-302b减轻了多个器官的老化变化，恢复了细胞增殖率，并通过RNA-seq分析揭示了其在衰老组织中恢复增殖标志物和减少炎症标志的作用。总体而言，miR-302b的长期递送有效减缓了衰老过程，改善了衰老迹象。
图7.长期 miR-302b 递送延缓衰老过程
本研究探讨了miR-302b在细胞增殖、衰老及其相关疾病中的作用，发现miR-302b通过靶向细胞周期抑制因子Cdkn1a和Ccng2，能够逆转细胞周期停滞，促进细胞增殖，从而改善衰老小鼠的身体和认知功能，并延长其寿命而不增加疾病负担。此外，miR-302b还可能通过重新激活细胞周期来恢复衰老组织的功能。总之，研究表明miR-302b作为核酸治疗的候选物，有用于对抗衰老及与年龄相关的疾病的潜力。
图8.作用机制图
本文作者: HXQ
责任编辑: CT
全文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413124004819
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