PD-1作为CD8+T细胞表面上的特征之一曾被应用于肿瘤免疫逃避等相关治疗。抗PD-1治疗曾经被认为可以促进CD8+T细胞的扩增和细胞因子的产生。然而，最近的研究发现健康成年人外周血中存在大量具有效应记忆表型和功能的PD-1+ CD8+T细胞，其可以显著扩增至自身免疫性肝炎（AIH）患者的肝脏中。此外，这些PD-1+ CD8+T细胞与血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平呈正相关。
今天分享一篇发表在《Advanced Science》的文章题为“PD-1+ CD8+T Cell-Mediated Hepatocyte Pyroptosis Promotes Progression of Murine Autoimmune Liver Disease”的研究论文。该研究对自身免疫性肝病模型小鼠进行实验，其疾病表型与人类原发性胆汁性胆管炎(PBC)和自身免疫性肝炎(AIH)相似，而CD8+T细胞是致病效应细胞。其中，肝脏特异性扩增的PD-1+ CD8+T细胞作为一个重要的致病细胞亚群表现出了高活性与对靶细胞的强细胞毒能力。此外，PD-1+ CD8+肝T细胞通过产生高水平的颗粒酶B和穿孔素-1诱导GSDMD介导的肝细胞凋亡。本研究为寻找潜在的治疗靶点提供了新的思路。
研究首先对dnTGFβ RII Aire−/−小鼠中是否存在致病性CD8+T细胞亚群进行检测，对各组小鼠分离的肝淋巴细胞进行了靶向单细胞RNA-seq测序，筛选其中的T细胞进行marker标记分类细胞簇。根据样本的t-SNE图对比各类CD8+T细胞簇的增减情况，同时还发现了一个小的CD4+T簇，显示在dnTGFβ RII Aire−/−小鼠中富集。该CD4+T细胞簇高水平表达IL-10、IL-21、Ifng等多个重要的功能分子，其他的CD4+T胞簇在各组小鼠的检测结果之间没有发现显著差异。
接下来，该研究对各组小鼠肝脏的分选淋巴细胞进行了单细胞TCR-seq。结合单细胞RNA-seq和TCR-seq数据的综合分析表明，前10个TCR克隆中的大多数在两个Pdcd1 + CD8+T细胞簇（T07和T10）中富集，同样这两个细胞簇也在dnTGFβ RII Aire−/−小鼠中大量扩增。扩增最多的TCR占所有TCR克隆的3.6%;前10个TCR克隆的总百分比为9.3%。此外，C3和C5克隆型也仅在dnTGFβ RII Aire−/−小鼠的肝脏中观察到。我们还发现T07和T10中的TCR克隆高度重叠。差异表达基因分析表明Pdcd1 + CD8+T细胞表达更高水平的免疫检查点分子，包括Lag 3、Pdcd 1、Havcr 2等基因高度表达。GSVA分析显示，Pdcd1 + CD8+T细胞中的几个重要途径上调，包括Th 1细胞毒性模块和白细胞介导的细胞毒性途径。这些结果表明，Pdcd 1 + Cd 8a + T细胞是dnTGFβ RII Aire−/−小鼠肝脏中主要的克隆扩增亚群，表明这些细胞群可能代表了关键的致病性CD 8 + T细胞亚群。
研究首先通过流式细胞术在蛋白水平分析 PD-1及 CD44、CD62L、CD69 表达水平，根据各组小鼠肝脏中的CD8+T细胞基于这些表面标志物表达呈现五个不同簇，分裂 t - SNE 图表明dnTGFβ RII Aire−/−小鼠肝脏中大规模扩增的CD8+T细胞表达CD69+PD-1+。用多重免疫组化方法检测肝脏中PD-1和 CD8 表达，显示 PD-1+ CD8+ T 细胞在 dnTGFβ RII Aire−/−小鼠肝脏中扩增且浸润于汇管区和小叶。流式细胞术检测发现该类型细胞在dnTGFβ RII Aire−/−小鼠脾脏、血液或胸腺中极少。随后从dnTGFβ RII Aire−/−小鼠肝脏中分选PD-1-和PD-1+ CD8+ T 细胞，过继转移到 Rag1−/−小鼠，12 周后检测发现受体肝脏中转移的 PD-1+ CD8+ T细胞比例高，其他组织低；转移的PD-1- CD8+ T 细胞在血液、脾脏和肝脏中比例相当，且接受供体PD-1- CD8+ T细胞的受体小鼠肝脏中有约 30% 的 PD-1+ CD8+ T细胞。综合表明PD-1+ CD8+ T细胞是dnTGFβ RII Aire−/−小鼠肝脏中特异性扩增的亚群。
随后对PD-1+ CD8+ T细胞展开进一步研究，关于细胞功能特性，dnTGFβ RII Aire−/−小鼠中的PD-1+ CD8+T细胞产生高水平干扰素IFN - γ。同时，该小鼠肝CD8 + T细胞中颗粒酶 B 水平也显著提高，且PD-1+ CD8+ T细胞的颗粒酶 B 水平高于对照组。同时PD-1+ CD8+ T细胞比PD-1+ CD8+T细胞更大，表达更高水平的 Ki - 67。标记Tim 3后发现其具有对靶细胞的细胞毒性作用。综上表明，dnTGFβ RII Aire−/−小鼠肝脏中扩增的PD-1+ CD8+T细胞具有强功能活性和细胞毒性。随后设计特异性靶向PD-1+细胞的 CAR - T 细胞进行体内实验，结果显示，接受 CAR - T 治疗的dnTGFβ RII Aire−/−小鼠肝脏中PD-1+ CD8+T细胞频率显著降低，证实 CAR - T 对其有效清除能力。同时，PD-1+细胞的清除改善了小鼠存活状态，减轻了肝脏病理损伤和炎性浸润，证实PD-1+ CD8+ T细胞在该小鼠自身免疫性肝病发展中有重要致病作用。
随后对模型小鼠肝脏疾病进展机制展开研究，对比dnTGFβ RII Aire−/−与对照小鼠肝脏中脓毒性相关蛋白，发现前者肝脏中 N - GSDMD、裂解的 caspase - 1 和 IL - 1β 水平显著升高，NLRP 3 表达上调，GSDME 和 caspase 3 裂解水平无显著差异，提示 GSDMD 介导的焦亡途径激活。后续给予 GSDMD 介导孔形成的特异性抑制剂双硫仑（DSF），结果显示 dnTGFβ RII Aire−/−小鼠存活率显著提高，免疫病理学显著减轻，且该组小鼠肝脏中 N - GSDMD 水平高于对照小鼠。随后进行体外共培养实验通过细胞凋亡观察发现PD-1+ CD8+ T细胞可诱导肝细胞出现凋亡形态学变化。双染色试验及共聚焦荧光成像显示，与PD-1+ CD8+ T细胞共培养的原代肝细胞呈现典型焦亡特征，培养上清液中 LDH 检测表明共培养显著诱导肝细胞更高死亡率。GSDMD 敲除实验则证明其有效抑制了PD-1+ CD8+ T细胞诱导的 AML 12 细胞焦亡、细胞毒性及半胱天冬酶 - 1 活化。而使用PD - 1靶向 CAR - T 细胞消耗小鼠中的 PD - 1+细胞，免疫组化结果显示肝脏中 N - GSDMD 水平显著降低；RNA - seq 数据分析表明，CAR - T 细胞处理后的小鼠肝脏整体基因表达模式更接近野生型小鼠，脓毒性相关通路富集水平和脓毒性相关基因表达水平显著降低。综上，小鼠中的肝脏PD-1+ CD8+ T细胞可通过诱导肝细胞中 GSDMD 介导的焦亡促进疾病进展。
为了证实PD-1+ CD8+ T细胞通过产生颗粒酶 B 和穿孔素- 1诱导靶细胞凋亡，且主要通过颗粒酶介导靶细胞凋亡，采用 Transwell 实验探究细胞凋亡与直接接触的关系，发现无直接接触时，上室的PD-1+ CD8+ T细胞仍能诱导 AML 12 细胞焦亡，表明PD-1+ CD8+ T细胞可通过分泌活性分子诱导靶细胞凋亡。同时蛋白质组学分析发现dnTGFβ RII Aire−/−小鼠的 PD-1+ CD8+ T细胞上清液中颗粒酶 B、IFN - γ 和穿孔素 - 1 含量较高。在共培养体系中，用颗粒酶抑制剂 DCI 预处理PD-1+ CD8+ T细胞，显著抑制了 AML 12 细胞凋亡，而 IFN - γ 受体阻断抗体处理对靶细胞凋亡无影响。本研究通过检测PD-1+ CD8+ T细胞特性、细胞分化与组织分布、功能和致病分子机制来揭示自身反应性CD8+ T细胞细胞通过诱导靶细胞焦亡促进疾病进展，填补了相关研究空白。
本文作者:LQY
责任编辑:TJY
全文链接:
https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/advs.202407284
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