高尿酸血症(HUA)是由肾脏分泌不足、分泌过多或肠道分泌不足导致的血清尿酸(SUA)水平过高引起的代谢疾病。HUA是与多种代谢紊乱(包括糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、肾脏疾病和痛风)相关的显著风险特征。由于编码尿酸氧化酶(Uox)(也称为尿酸酶)的基因突变，尿酸(UA)成为一些哺乳动物，特别是人类嘌呤代谢的酶促终产物。在参与尿酸代谢的酶序列中，Uox是第一个将尿酸盐代谢成尿囊素的酶；一种易于通过肾脏排泄的水溶性形式。
各种常规治疗方法通常用于治疗HUA，例如丙磺舒(尿酸)和别嘌呤醇(黄嘌呤氧化酶抑制剂)。丙磺舒增加排尿，从而增加尿酸盐晶体的排泄，而别嘌醇通过抑制黄嘌呤氧化酶减少尿酸生成来缓解症状。然而，排尿增加会增加尿酸盐晶体的排泄，从而导致肾脏损伤。同时，尿酸生成减少可能导致低尿酸血症，从而干扰身体的正常代谢功能。蛋白质和酶替代疗法通过核酸(mRNA、DNA等)发生。)或直接蛋白质输送。然而，与蛋白疗法相比，通过mRNA介导的蛋白表达进行治疗性蛋白替代具有明显优势。基于此，黄渊余团队证明了一种治疗高尿酸血症的返祖策略，该策略基于肝细胞内Uox的内源性表达，该表达是由载有称为iLAND的可电离脂质纳米颗粒的mRNA (mUox)介导的。mUox@iLAND允许体外有效转染和蛋白质表达。
研究结果:1. mUox@iLAND的物理化学特性和细胞进入。
首先用pcDNA3.1构建含有Uox表达序列的质粒。用BstZ17I(一种限制性内切酶)线性化质粒后，通过体外转录(IVT)制备表达Uox的mRNA(mUox)。同时，使用称为A1-D1-5的可电离脂质，与DOPE、胆固醇和PEG-DMG2000一起装载mRNA(图1A和补充图S1)。使用动态光散射(DLS)表征物理化学性质，包括流体动力学尺寸、多分散指数(PDI)和ζ电势。结果表明，mRNA@iLAND的流体动力学大小、PDI、ζ电位和包封率分别为～169.1±1.643nm、0.148±0.005、-1.22±0.188mV和94.2±0.887%(图1B和补充图S2)。使用透射电子显微镜(TEM)来确定形态，并且获得直径小于200 nm的均匀球形(图1C)。记录相同样品的大小和PDI 15天，发现mRNA@iLAND显示出良好的稳定性，大小和PDI分别主要在200 nm和0.18左右(图1D)。类似地，可电离的LNP可以通过与内体膜的阴离子脂质(如酸性环境中的磷脂酰丝氨酸)相互作用实现有效的内体逃逸，从而将有效载荷(通常为核酸)稳定地传递给靶细胞。因此，pKa被认为是细胞内可电离的LNP逃逸行为的一个起作用的因素。因此，它必须达到或超过5.5，并应小于7.0；否则，NPs系统很难预测体内核酸携带效率。结果，通过2-(对甲苯胺基)-6-萘磺酸(TNS)分析记录的iLAND的pKa值为6.02(图1E)。小于6.5的pKa值意味着iLAND将在内体中质子化，导致脂质与内体膜融合，从而有效地将mRNA释放到胞质溶胶中。一般来说，pKa值范围在5.5-7.0之间(更准确地说，在6.0-6.9之间)是最常报道的体内递送核酸可接受的范围。
为了阐明递送效率和亚细胞定位，iLAND与表达荧光素酶的mRNA和Cy5标记的siRNA (Cy5核酸，Cy5-NA)共包被。通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和荧光激活细胞分选术(FACS)评估Cy5-NA@iLAND (iLAND)在Hepa1-6细胞系中的细胞内化行为。由于其体外转染效率，Cy5-NA@Lipo2000 (Lipo2000)被用作标准。荧光成像数据显示，与Lipo2000相比，有效载荷被iLAND成功递送到细胞中。来自iLAND和Lipo2000的Cy5荧光信号在细胞质中观察到，在细胞核周围的某处(图1F)。这些结果与定量分析数据(图1G)一起表明，在体外，Lipo2000的细胞内化略高于iLAND。然而，与Lipo2000相比，iLAND显示出更有效的核内体逃逸(图1H)。
研究结果2：iLAND的体外性能
Lipo2000通常通过经典的胞吞途径如网格蛋白、小窝或raft依赖性途径32将有效载荷转染到细胞中。而iLAND通过配体(载脂蛋白E，ApoE)-受体(低密度脂蛋白受体，LDLR)识别以及膜窖依赖性途径介导核酸转染(图2A，B。这一特性，加上更好的内体逃逸，使得iLAND适合体内给药。另一方面，Lipo2000是代表性的和广泛使用的阳离子体外转染剂，但是当用于体内时具有缺点(例如，诱导明显的毒性)。
上述结果表明，iLAND成功地将货物运送到细胞内。因此，我们还检查了mUox@iLAND的Uox表达。为此，我们将mUox封装在iLAND和Lipo2000中，并使用这些制剂转染Hepa1-6细胞。模拟组也显示了细胞系表达的Uox的预期水平；然而，Lipo2000和iLAND组显示了Uox的有效过表达(图2C)。mUox@iLAND和mUox@Lipo2000显示Uox的表达升高。这种情况被认为是通过将尿酸转化为尿囊素来抑制尿酸在肝脏中的积累。高水平尿囊素的形成可以通过正常的排尿过程排出，而不会影响肾脏。进一步研究iLAND的细胞内运输，并使用CLSM记录转染后1、3、5、8、10和12小时Hepa1-6细胞中Cy5的荧光信号。Lipo2000和Mock分别用作阳性和阴性对照。结果表明，细胞内Cy5信号的增加与更长的转染时间成正比。Lipo2000和iLAND显示更高的细胞内Cy5荧光信号；然而，iLAND递送的Cy5信号的增加模式随着比Lipo2000更长的转染时间而不断增强(图2E–I)。
此外，还通过计算皮尔逊相关分析了Cy5和内体/溶酶体的共定位(图2G和2I)。观察到在3小时转染时间后，iLAND具有比胞吞速度更快的内体逃逸(图2I)。这些结果可以详细说明iLAND在3小时转染时间表现出最大的Pearson相关，表明iLAND在细胞内化后主要位于内体/溶酶体中。在3小时转染时间后，很明显有效载荷成功地从内涵体/溶酶体中逃逸，因为Pearson相关性在5小时及以后逐渐降低。与iLAND相比，Lipo2000触发了细胞内大量Cy5的内化。3小时后，随着转染时间的增加，Pearson相关性逐渐增加，这表明Cy5可能不能快速从内涵体/溶酶体中逃逸。据报道，近3.5%(或甚至不到1%)的内化核酸可以从内体中逃逸出来，并释放到胞质溶胶中以执行特定的功能36，37。狭窄的内体逃逸进一步加强了建立先进递送的需要，因此，阐述了缺乏具有快速内体飞行能力的递送载体的发展38，39。因此，进行该实验以探索和评估iLAND的内体逃逸能力，并将其与作为转染试剂的商业使用的金标准Lipo2000进行比较。
研究结果3：Cy5-NA@iLAND的体内生物分布和mRNA表达
研究者使用体内成像研究iLAND在健康C57BL/6 J小鼠中的体内生物分布性能。Dlin-MC3-DMA和SM102，两种商业化的核酸治疗剂或疫苗所使用的两种可电离的脂质，在本实验中被引入作为对照。静脉注射后，Cy5-NA@iLAND迅速并主要积聚在肝脏。给药后，在每个时间点(1小时、3小时、6小时和24小时)测定Cy5荧光信号。观察到与MC3和SM-102组相比，iLAND显示出最高的Cy5荧光(图3A)。在给药后3，6小时记录到增强的Cy5荧光。为了更准确地理解和分析iLAND在每个器官和各种组织中的生物分布，在注射后3、6、24和48小时对每组中的一只小鼠实施安乐死并解剖(图3A)。注射后3小时，大部分iLAND积聚在肝、脾和肾中，如高Cy5荧光所观察到的。注射后最初3小时后，iLAND显示出显著的Cy5信号。此外，在给药后3-6小时左右也观察到了峰值荧光信号(图3B，C)。数据还显示肝脏是iLAND大量积累的主要靶器官，这进一步证实了装载mUox的iLAND在Uox表达中的作用，因为该酶位于肝脏中。
在该试验中，LNPs也共包封荧光素酶表达mRNA (mLuc)。因此，在指定的时间点也记录了生物发光。如图3D、E、F所示，最大蛋白表达在注射后约3-6小时达到。当在每个时间点(3、6、24和48小时)处死一只小鼠时，观察到相同的趋势，并且在注射后3-6小时也观察到大量的蛋白质表达。荧光和生物发光信号主要可以在肝脏中检测到；然而，脾脏中也有少量残留。有趣的是，也有记录表明iLAND几乎不在心脏、肺和颌下腺中积聚。还研究了iLAND在健康Balb/c小鼠(另一种小鼠物种)中的体内生物分布和mRNA表达(补充图S6、S7和S8)，其揭示了相似的体内分布模式。总之，这些结果表明，在分布阶段，iLAND在肝脏中迅速而主要地积累。进行FACS和肝脏冷冻切片来阐明肝脏中的哪些细胞类型已经内化了iLAND纳米颗粒。注射后两小时，收集肝组织并制备信号细胞。结果表明，肝细胞中iLAND阳性细胞的总量远大于肝巨噬细胞细胞。
仔细分析了从接受Cy5-NA@iLAND、Cy5-NA@MC3或Cy5NA@SM-102处理的小鼠制备的肝脏冷冻切片的共聚焦显微照片。如图3G所示，星号表示代表性肝细胞，箭头表示代表性非实质细胞(包括肝巨噬细胞和肝星状细胞等)。我们观察到Cy5-NA@MC3和Cy5-NA@iLAND优先积聚在肝细胞中，与肝窦中的非实质细胞关联最小。值得注意的是，大量的Cy5-NA@SM-102被非实质细胞内吞。此外，Cy5NA@iLAND和Cy5-NA@MC3在肝脏中的相似分布表明了mUox@iLAND用于临床治疗的有希望的潜力。
研究结果4：持续高尿酸血症小鼠模型的体内疗效研究。
在这项研究中，研究者成功地建立了稳定的高尿酸血症小鼠模型。结果表明，服用一剂siRNA，HUA的病情可稳定数周。通过在预定时间点测量血清尿酸(SUA)水平来确定mUox@iLAND的治疗效果。第一次测定每组的SUA水平被认为是正常的。使用GalNAc-siRNA（可抑制尿酸代谢）后，SUA水平升高，两周后发现SUA水平增加了3倍(图4A，B)。在成功诱导HUA病症后，用别嘌醇和mUox@iLAND治疗HU小鼠，而用PBS给药的小鼠和正常小鼠被标记为阳性和阴性对照。该研究持续到mUox@iLAND显示出治疗效果；因此，注意到持续的治疗效果直到14天(图4C)。可以看出，与每日剂量的别嘌呤醇相比，单剂量的mUox iLAND(0.5mg/kg)在整个研究期间显示出持续的功效。相比之下，PBS组一直表现出高SUA水平。它揭示了在这项研究中提出的小鼠模型可以在更长的时间内提供稳定的HU条件，这最终可以解决与以前使用的各种HU小鼠模型相关的缺点。此外，动物脏器的切片结果以及血生化指标表明，与空白组相比，mUox iLAND的给药并没有引起生物毒性。
文章总结：本研究为高尿酸血症的治疗提供了一个有前途的基于mRNA的治疗方案。通过采用“返祖”策略，表达Uox的mRNA被设计并装载了基于A1-D1-5的离子化脂质的专有LNP递送系统。在啮齿动物模型中观察到有效和持久的SUA降低，以及理想的安全性，包括一个内部建立的模型。
本文作者： HHK
责任编辑：TJY
全文链接：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-50752-9
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