结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，目前，手术切除和化疗是结直肠癌治疗的主要选择。当肿瘤克服细胞衰老后才会发展为恶性肿瘤，非恶性衰老的肿瘤细胞可被免疫细胞清除，从而有效抑制。因此，诱导肿瘤细胞衰老可能是一种潜在的治疗癌症的方法，其已成为药物开发的新前沿。虽然细胞衰老是一种稳定的细胞周期停滞状态，但这种现象并非完全不可逆，一些细胞可以逃离细胞周期停滞状态，导致癌症复发。因此，在癌症治疗的背景下，能够诱导肿瘤细胞衰老的药物的发现同时通过下调PD-L1的表达激活免疫系统，可以显著增强对癌细胞的免疫应答，促进衰老细胞的清除。这种策略的实现将为癌症治疗引入一种新的、更有效的方法。然而，已经开发了多种抗衰老药物它们的全身毒性和耐药性极大地限制了它们的临床应用。虽然一些报道表明天然产物可以降低肿瘤细胞中PD-L1的表达，但其临床应用尚不清楚。在肿瘤细胞中既能诱导细胞衰老又能降低PD-L1表达的药物鲜有报道。
目前小檗碱已被用于治疗糖尿病、胃肠炎、多囊卵巢综合征等疾病，其可抑制CSN5的去泛素化活性，降低癌细胞中PD-L1的表达，促进抗肿瘤免疫。B68是小檗碱修饰的衍生物-从小檗科、毛茛科、芸香科等科天然植物中提取的季异喹啉类生物碱改性合成的的化合物。在本研究中，我们发现小檗碱修饰的衍生物B68靶向CSN5，其作用与小檗碱相似，可以降低PD-L1的水平。此外，B68通过靶向BMI1诱导癌细胞衰老，这是小檗碱无法做到的，这将为难治性癌细胞的治疗提供新的前景。
1.B68显著促进结直肠癌细胞衰老
研究首先对小檗碱进行了一系列的结构修饰，同时通过CCK-8实验和集落形成实验，我们发现与小檗碱（B1）相比，B68对RKO细胞和HCT116细胞的肿瘤生长具有特异性抑制作用，而对正常人肠上皮细胞（NCM460）几乎没有毒性作用。研究同时采用EdU实验和calcein-AM/PI双染色法分析B68对结直肠癌细胞增殖或细胞死亡的影响。结果表明B68能显著抑制RKO和HCT116细胞的增殖，且对凋亡的诱导作用较小，这与流式细胞术结果一致。B68显著提高了RKO和HCT116细胞在G0/G1期的比例，同时划痕法证明B68的应用导致细胞迁移明显减少。随后的免疫荧光实验也证实了这一点。为了进一步确定B68诱导衰老的机制，我们评估了下游靶点p21。B68在CRC细胞中显著上调p53的转录，从而促进p21的表达。综上所述，与小檗碱不同，改性小檗碱衍生物B68可以通过诱导肿瘤细胞衰老来抑制细胞生长。
2.B68诱导衰老抑制异种移植小鼠结直肠癌生长
为了进一步确定B68诱导衰老的抗肿瘤作用，建立了HCT116和RKO异种移植裸鼠模型。结果显示B68明显抑制HCT116和RKO肿瘤生长、肿瘤大小和肿瘤重量，而小檗碱没有治疗效果。同时小鼠模型中 p16， p53和p21的表达也显著增加。免疫组化（IHC）结果显示在b68处理的肿瘤异种移植小鼠中，增殖标志物降低，而凋亡标志物水平升高。此外，与对照组相比，B68对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等主要器官的病理改变没有明显改变。
3. B68抑制AOM/ DSS 诱导结肠癌的肿瘤生长
AOM/DSS模型是目前应用最广泛的溃疡性结肠炎（UC）化学诱导模型，可在短时间内观察其生物学效应。为了确定B68是否能减弱结直肠癌的形成，建立了AOM/DSS模型，对比而言B68处理组可显著抑制AOM/DSS诱导的肿瘤。与AOM/DSS小鼠相比，B68小鼠的结肠长度更长，体重更重，这表明AOM/DSS小鼠更容易发生肿瘤，因为DSS诱导的小鼠结肠长度缩短是炎症严重程度的一个指标，是结肠癌发生的潜在原因。在B68治疗后，肿瘤内CD8细胞的数量显著增加，而PD-L1和Foxp3的水平显著降低。
4.B68通过靶向BMI1诱导结直肠癌细胞衰老
5. BMI1的ARG123对B68的结合至关重要
6.B68诱导细胞衰老的免疫原性，增强抗肿瘤免疫
关于SASP 及相关基因表达分析，转录组学结果表明，与非衰老对照组相比，B68 诱导的衰老 MC38 细胞中干扰素（IFN）转录特征上调，参与 MHC - I 抗原加工和递呈的主要基因成分上调，这一结果经 qRT - PCR 分析证实。关于抗原呈递能力检测，通过流式细胞术检测发现， B68 增强了衰老细胞加工和呈递 MHC - I 抗原的能力。同时根据体内免疫募集分析、树突状细胞激活实验和抗肿瘤保护作用验证表明 B68 诱导的衰老癌细胞免疫可促进抗肿瘤免疫反应。
7. B68通过靶向CSN5介导PD-L1降解
考虑到小檗碱可以调节PD-L1的表达从而发挥抗肿瘤免疫作用，研究了化合物B68是否可以降低PD-L1的水平。通过 WB、流式细胞术和免疫荧光实验，发现 B68 能依赖性地降低 RKO 和 HCT116 细胞中 PD - L1 的表达，表明其具有抗肿瘤免疫作用。用重组 PD - 1 蛋白和荧光抗体孵育 B68 处理的 RKO 细胞，通过共聚焦显微镜检测，以及 B68 处理的 RKO 和 HCT116 细胞与 T 细胞共培养实验，均表明 B68 能降低细胞活力。同时分子对接和微尺度热泳（MST）实验显示 B68 可能通过靶向 CSN5 蛋白的 Glu76 位点介导 PD - L1 的降解，免疫沉淀（IP）实验证实了 CSN5 与 PD - L1 之间的相互作用，进一步表明 B68 通过靶向 CSN5 介导泛素化介导的 PD - L1 降解 。
8. B68通过促进肿瘤细胞衰老和增强T细胞浸润抑制MC38肿瘤生长
9.B68可增强抗ctla4介导的结直肠癌抑制作用
研究基于 B68 能诱导细胞衰老、降低肿瘤细胞 PD - L1 表达且与抗 PD - L1 和抗 CTLA4 合用效果更好的情况，假设 B68 与抗 CTLA4 合用可增强抗肿瘤活性，并通过 MC38 小鼠肿瘤模型进行验证，发现B68 在不影响小鼠体重的前提下，显著抑制肿瘤生长，效果优于抗 PD - 1 和抗 CTLA4，说明其除免疫检查点抑制途径外，还通过诱导衰老抑制肿瘤。同时发现B68 与抗 CTLA4 联合治疗较单独治疗或抗 CTLA4 单药治疗，能显著减小肿瘤大小。
10. bmi1、CSN5和PD-L1蛋白在人肿瘤组织中的表达水平
为了证实上述模型在人类肿瘤组织中的有效性，我们评估了6例结肠癌患者的癌旁和肿瘤组织中CSN5、BMI1和PD-L1的蛋白水平。此外，利用TIMER 2.0数据库，分别研究了PD-L1和CSN5的表达与结肠（COAD）和直肠腺癌（READ）中免疫细胞浸润程度之间的相互作用。结果表明BMI1表达升高与结直肠癌患者的不良预后相关。CSN5或PD-L1的过表达与肿瘤诱导的免疫抑制有关，而接受PD-1抗体治疗的患者表现出延长的生存期。
结论
本文围绕细胞衰老与肿瘤发展的关系，介绍了小檗碱修饰衍生物 B68 在抗肿瘤方面的研究。B68 具有双重抗肿瘤作用机制，既能促进肿瘤细胞衰老抑制增殖，又能调节 PD-L1 表达触发免疫应答，还具备作为治疗性疫苗的潜力，为结直肠癌治疗提供新策略。
本文作者：LQY
责任编辑：LQY
全文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202413122
文字仅代表个人观点，如有侵权或错误，请联系删除或修改
