非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种慢性进展性疾病，主要特征为肝细胞内脂肪变性和过度脂质积累。由于NAFLD与肥胖、糖尿病及其他代谢紊乱密切相关，2020年有学者建议将其更名为代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）。最近一项Meta分析显示，全球成人MAFLD的患病率高达50.7%，预计到2030年将进一步增加。目前，MAFLD的治疗主要依赖降糖、降脂和降压药物，但仍缺乏FDA批准的特效药物。而MAFLD相关的发病率和死亡率依然很高，因此迫切需要新疗法。
研究表明，自噬功能障碍与MAFLD的发生密切相关，提高肝脏自噬水平有助于减轻脂质沉积。因此，药物通过上调自噬活性可能成为改善MAFLD的新策略。转录因子EB（TFEB）是自噬-溶酶体途径的关键调控因子，能够调节自噬相关基因的表达，Beclin1和LAMP1是其重要靶基因。激活TFEB不仅能促进自噬过程，还能增强细胞内物质的清除。此外，腺苷5′-单磷酸腺苷（AMP）-活化蛋白激酶（AMPK）-Sirtuin去乙酰化酶1（SIRT1）通路被认为是增强TFEB功能的重要机制。AMPK的活化能够促进SIRT1的激活，进而增强TFEB的功能，调节自噬和溶酶体相关基因的表达。近年来，中医药在MAFLD的预防和治疗方面取得了显著进展。
近日，Pharmacological Research发表文章“AlphaFold-Based AI Docking Reveals AMPK/SIRT1-TFEB Pathway Modulation by Traditional Chinese Medicine in Metabolic- Associated Fatty Liver Disease”。该研究探讨了国医大师王琦院士研制的中药方剂“芪桂降脂方”（QGJZF）对MAFLD的改善作用。通过高脂饮食诱导的斑马鱼和金黄仓鼠模型，以及棕榈酸酯（PA）和油酸（OA）诱导的HepG2细胞模型，结果表明QGJZF能够通过AMPK/SIRT1-TFEB自噬-溶酶体通路发挥作用。网络药理学分析初步确定了关键靶点，结合AlphaFold蛋白结构预测，证实AMPK在QGJZF的作用机制中起着关键作用。通过高效液相色谱法和AMPK激酶活性实验，发现QGJZF能够直接激活细胞内AMPK，并且柚皮苷、(+)-儿茶素水合物和儿茶素是其关键成分。这些结果表明，AMPK/SIRT1-TFEB轴可能是MAFLD的重要治疗靶点，而QGJZF及其活性成分有望成为治疗MAFLD的有效药物。
1、QGJZF对HFD诱导的脂质代谢紊乱的影响
该研究采用高脂饮食（HFD）诱导的斑马鱼和金黄仓鼠模型，评估芪桂降脂方（QGJZF）的降脂效果。在斑马鱼模型中，高剂量组（2000 μg/mL）和阳性对照组ATO的干预显著降低了总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平，且QGJZF能够改善斑马鱼血流速度和眼部血管厚度。此外，QGJZF和ATO治疗均减少了巨噬细胞的数量，提示其抗炎作用。在金黄仓鼠模型中，经过8周的HFD饲喂，仓鼠体重和肝脏重量明显增加。而给予QGJZF后，这些变化被有效逆转。H&E染色结果显示，QGJZF处理后，肝细胞组织结构更加正常，细胞肿胀和空泡化现象减少。油红O（ORO）染色测试也显示QGJZF显著减少了肝脏脂滴的数量及大小。提示QGJZF对HFD诱导的肝功能损伤具有一定保护作用。
图 1 QGJZF改善HFD斑马鱼和金黄仓鼠的脂质积累
2、网络药理学分析和AlphaFold预测QGJZF治疗MAFLD的潜在靶点和结构
研究者在SymMap平台上检索方中八味中药，发现2863个相关靶标，GeneCards显示其中613个与MAFLD相关的目标。通过生物信息学分析，确定了QGJZF与MAFLD的199个共同靶点，构建的共同目标网络中显著的枢纽靶点为PRKAA2（AMPK）和SIRT1。利用AlphaFold3预测，其结构准确性得分高，PRKAA2的排序得分为0.97，SIRT1为0.93，表明预测结果可靠，为后续实验提供了理论支持。
图 2 网络药理学分析和AlphaFold预测QGJZF治疗MAFLD的潜在靶点和结构
3、QGJZF通过激活AMPK/SIRT1-TFEB通路改善MAFLD金黄仓鼠的脂质积累
透射电镜（TEM）研究显示，QGJZF能显著减少金黄仓鼠的肝细胞中脂滴数量，同时显著增加自噬体和自噬溶酶体数量，且脂滴与自噬溶酶体数量之间存在显著负相关。自噬相关蛋白LAMP1、ATG3和LC3-II在模型组中均下调，而QGJZF处理后肝脏的p62和自噬标志物Beclin1水平上调。此外，QGJZF能促进TFEB核内表达，增加AMPK的磷酸化，逆转HFD诱导的SIRT1下调。免疫组化结果显示，QGJZF提高了p-AMPK和SIRT1的表达，表明其通过激活AMPK/SIRT1-TFEB通路改善MAFLD相关的脂质积累。
图 3 QGJZF促进HFD金黄仓鼠中自噬溶酶体的表达，上调AMPK/SIRT/TFEB的表达
4、QGJZF对体外细胞脂质积累和自溶酶体形成的影响
为研究QGJZF对体外脂肪堆积的影响，通过使用油酸（OA）和棕榈酸（PA）处理HepG2细胞，并评估QGJZF的降脂作用。结果表明，QGJZF有效减少了TC和TG的水平，并显著降低AST和ALT水平，显示出对OA/PA损伤的保护作用，且效果优于阳性对照药物ATO。ORO染色和透射电镜分析发现，QGJZF显著减少了细胞内的脂滴数，并增加了自噬体和自噬溶酶体的数量，从而增强其自噬功能。Western blot结果显示QGJZF激活了AMPK/SIRT1-TFEB通路。
研究者进一步探讨了QGJZF是否通过TFEB介导其降脂作用。在OA/PA诱导的HepG2细胞中，QGJZF上调TFEB的作用被TFEB siRNA逆转。QGJZF处理后，细胞内脂滴数量减少，而溶酶体和脂滴的共定位增加，表明其通过溶酶体途径减少脂滴。转染TFEB siRNA后，QGJZF降低脂质积累的作用显著减弱，同时，QGJZF上调自噬相关蛋白Beclin1、ATG3、LC3-II和LAMP1的表达受抑制。
此外，使用AMPK抑制剂化合物C（CC）后，QGJZF诱导的自噬通量增加被显著抑制，显示降脂效果的减少。
图 4 QGJZF通过AMPK诱导激活自噬溶酶体
5、QGJZF及其主要活性成分通过激活AMPK改善脂质沉积
尽管QGJZF能激活AMPK并减少脂质沉积，但具体机制尚不清楚。研究者采用了高效液相色谱法测量HepG2细胞中ATP、ADP和AMP的水平，并计算它们的比值。与对照组相比，QGJZF处理组的AMP/ATP和ADP/ATP比率无显著变化，表明QGJZF可能直接结合激活AMPK。进一步试验显示，QGJZF剂量依赖性地增加AMPK激酶活性。通过LC-MS和分子对接分析，筛选出芦丁、柚皮苷、香蜂草苷、(+)-水合儿茶素和儿茶素为潜在的AMPK激活剂。其中，柚皮苷、(+)-水合儿茶素和儿茶素显著增强AMPK活性，并能有效降低细胞内TC和TG水平，从而改善脂质沉积。
图 5 QGJZF及其主要活性成分通过直接结合AMPK改善脂质沉积
本文作者：HWY
责任编辑：LQY
全文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1043661825000428
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