大家好，今天和大家分享一篇发表在Acta Pharmacologica Sinica发表题为“Otilonium bromide ameliorates pulmonary fibrosis in mice through activating phosphatase PPM1A”的文章。在本研究中，作者研究了PF的分子发病机制和潜在治疗靶点，并发现了用于PF治疗的药物先导化合物。通过气管内滴注博来霉素(BLM，5mg/kg)在小鼠中建立了小鼠PF模型。作者发现PPM1A的蛋白水平在PF患者和BLM诱导的PF小鼠中显著下调。通过筛选实验室内部化合物库，我们发现Otilonium bromide（OB）是一种PPM1A酶激活剂，可显著改善小鼠的PF样病理。作者构建了肺组织中PPM1A特异性敲低的PF小鼠，并确定通过靶向PPM1A，OB治疗可通过TGF-β/SMAD3通路抑制成纤维细胞中的ECM沉积，可通过NF-κB/NLRP3通路抑制肺泡上皮细胞中的炎症反应，并减弱肺泡上皮细胞炎症与成纤维细胞中ECM沉积之间的串扰。总之，结果表明，肺PPM1A激活是PF的一种有前途的治疗策略，并强调了OB在该疾病治疗中的潜力。肺纤维化（Pulmonary Fibrosis, PF）是一种慢性、不可逆的致命性肺部疾病，其特征为肺泡上皮损伤、成纤维细胞异常活化及细胞外基质（ECM）过度沉积，最终导致肺组织结构破坏和呼吸衰竭。目前仅有两种药物（吡非尼酮和尼达尼布）被批准用于治疗PF，但其疗效有限且无法逆转疾病进程。此外，COVID-19后遗症中肺纤维化发病率显著上升，亟需探索新的治疗靶点和药物。
蛋白磷酸酶PPM1A（PP2Cα）是调控TGF-β/SMAD通路的关键分子，可通过去磷酸化p-SMAD2/3终止促纤维化信号。然而，PF患者和小鼠模型中PPM1A蛋白水平显著下调，但其机制及靶向策略尚未明确。
作者首先通过免疫荧光测定法检测患有严重肺纤维化负担的临床活检样本的PPM1A蛋白水平，结果表明与非纤维化个体相比，PF患者的肺PPM1A蛋白水平受到抑制。PF小鼠肺PPM1A蛋白水平受到抑制。为了进一步验证PPM1A在肺纤维化中的调节作用，我们通过气管内滴注BLM（5mg/kg）以建立小鼠PF模型。Western blot结果表明，与PBS处理的对照小鼠相比，PF小鼠的肺PPM1A蛋白水平也受到抑制（图1c、d），如上述临床样品测定结果一样。接下来，进行免疫荧光测定，包括PPM1A与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，成纤维细胞活化标记和表面活性蛋白-C(SP-C)的共染色，结果表明，在PF小鼠的肺中的PPM1A蛋白水平均受到抑制（图1）。
图1.肺纤维化患者和BLM诱导的肺纤维化小鼠的肺中PPM1A蛋白水平下调由于TGF-β是纤维形成的重要驱动因素，其次作者评估了OB在TGF-β1(2.5ng/mL)诱导的IMR90细胞中的潜在抗纤维化活性。Western blot检测结果表明，OB(10、20mM)降低了TGF-β1处理的IRM90细胞中α‐SMA和ECM相关蛋白(胶原蛋白1，COL1A1；纤连蛋白，FN)的水平。值得注意的是，Western blot结果表明SMAD3抑制剂SIS3可以消除OB抑制ECM相关蛋白的能力，因此该结果证实OB通过SMAD3信号传导抑制ECM沉积。此外，鉴于TGF-β在纤维形成中起着至关重要的作用，它促进SMAD3易位进入细胞核，诱导促纤维化基因的转录，进而促进肌成纤维细胞分化和ECM沉积，我们还研究了OB在调节IMR90细胞中TGF-β/SMAD3通路的作用。Western blot结果表明，TGF-β增强了p-SMAD3蛋白表达和SMAD3核易位的水平，而这种增强作用被OB处理所拮抗。因此，所有结果表明，OB通过TGFβ/SMAD3信号传导抑制了IMR90细胞中的成纤维细胞活化和ECM沉积。OB通过PPM1A抑制TGF-β/SMAD3信号传导。为了验证PPM1A是OB介导的TGF-β/SMAD3通路抑制所必需的，我们用si-PPM1A处理了IMR90细胞。通过免疫荧光和蛋白质印迹分析发现si-PPM1A剥夺了OB上述对抗SMAD3核转位和ECM相关蛋白表达的能力。因此，所有结果都表明OB通过PPM1A/TGF-β/SMAD3通路减弱了IMR90细胞中的ECM沉积（图2）。图2. OB作为PPM1A酶激活剂，通过PPM1A/SMAD3通路抑制IMR90细胞中的ECM沉积由于PF具有异常炎症反应，包括募集浸润性纤维化细胞和产生促炎细胞因子，作者接下来研究了OB的体外抗炎潜力。OB通过PPM1A抑制LPS/ATP处理的A549细胞中NLRP3炎症小体的活化。NLRP3炎症小体是由NLRP3、ASC和pro-caspase-1组成的多蛋白复合物，其活化导致caspase-1依赖的IL-1β分泌。此外，NLRP3炎症小体在PF进展中被激活。基于此，我们研究了OB对LPS和ATP（LPS/ATP）刺激的A549细胞（肺泡上皮细胞）中NLRP3炎症小体活化的影响。免疫组织化学测定结果表明OB（10，20mM）拮抗LPS/ATP引起的IL-1β蛋白水平升高。qRT-PCR和免疫荧光测定结果表明OB（10，20mM）拮抗LPS/ATP诱导的NLRP3mRNA水平以及NLRP3和ASC蛋白水平的增加。值得注意的是，si-PPM1A使OB（20mM）在A549细胞中失去上述拮抗能力。因此，所有结果都表明，OB通过PPM1A抑制了LPS/ATP处理的A549细胞中NLRP3炎症小体的活化。Western印迹和免疫荧光测定结果表明，OB拮抗了LPS/ATP诱导的A549细胞中p-NF-κB蛋白水平的增加(图3g，h)和NF-κB核易位，而si-PPM1A则剥夺了OB拮抗NF-κB活化的能力。综上所述，所有结果表明OB通过PPM1A/NF-κB/NLRP3/IL-1β通路抑制LPS/ATP处理的A549细胞中的炎症（图3）。图3.OB通过PPM1A/NF-κB/NLRP3/IL-1β通路抑制A549鉴于OB在体外确定的抗纤维化和抗炎能力，作者接下来评估了OB在改善小鼠PF样病理方面的潜力。在BLM滴注后第0、10或20天进行微型计算机断层扫描（Micro-CT）以评估PF的动态发展。Micro-CT结果表明，OB（2.5、5mg·kg-1·d-1）治疗减轻了PF小鼠的肺损伤。此外，OB治疗改善了PF小鼠的肺指数（肺重与体重的比率）和死亡率。同样，肺切片的羟脯氨酸测定和组织病理学分析（H&E和Masson染色）的结果也显示，PF小鼠的炎症反应和胶原沉积增强，肺结构遭到广泛破坏，而OB可保护PF小鼠免受肺部进一步的胶原沉积和病变。为了验证OB是否通过PPM1A对小鼠的PF样病理产生上述改善作用，还对肺组织中PPM1A特异性敲低的PF小鼠进行了相关测定。值得注意的是，所有结果都表明肺部PPM1A特异性缺陷会加重小鼠的肺纤维化。此外，OB在注射AAV-PPM1A的PF小鼠中失去了上述对PF样病理的改善作用（纤维化区域。总的来说，所有结果表明OB治疗通过PPM1A改善了PF小鼠的肺纤维化(图4)和(图5)。图5.OB治疗对患有PF的PPM1A缺乏症小鼠的PF没有影响
总结
本研究证实Otilonium bromide通过激活PPM1A，抑制TGF-β/SMAD3和NF-κB/NLRP3通路，并通过靶向PPM1A减弱肺上皮细胞炎症与成纤维细胞ECM沉积之间的串扰，从而改善肺纤维化。研究不仅为PF治疗提供了新策略，也为COVID-19后肺纤维化的药物开发指明方向。
本文作者：ZWT
责任编辑：TJY
全文链接：
https://www.nature.com/articles/s41401-024-01368-8
文字仅代表个人观点，如有侵权或错误请联系删除或修改
