急性肝衰竭（ALF）是一种肝脏急症，具有快速的肝脏破坏、多器官衰竭和高死亡率。尽管进行了数十年的研究，但已建立的ALF的治疗选择很少。生物活性小分子SCM-198是 益母草碱的合成形式，其已证明在各种病理过程中具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，然而，尽管对SCM-198在神经和心血管系统中的研究多年，但其特异性结合靶点仍未确定，阻碍了其转化应用。
同济大学林古法/王志荣/程黎明团队科研团队在期刊《Nature Communications》发表题为“Selectively targeting the AdipoR2-CaM-CaMKII-NOS3 axis by SCM-198 as a rapid-acting therapy for advanced acute liver failure”的研究论文。结果表明，脂联素受体2（Adiponectin receptor 2, AdipoR2）是SCM-198的选择性靶点，AdipoR2（R335）氨基酸残基是SCM-198-AdipoR2结合和信号传导的关键作用靶位点，AdipoR2（Y274）氨基酸残基是细胞胞外Ca2+内流的分子开关。SCM-198-AdipoR2的结合诱导细胞胞外Ca2+内流，上调该团队发现的AdipoR2-CaM-CaMKII-NOS3复合物的活性，迅速上调一氧化氮的产生，从而发挥快速促进ALF小鼠肝脏损伤修复的作用。
首先，作者通过注射TAA（硫代乙酰胺：200 mg/kg） 或APAP（对乙酰氨基酚：400 mg/kg） 诱导成年小鼠的ALF评价了SCM-198的治疗效果。结果表明，SCM-198显著延长了TAA或APAP中毒的治疗窗口期。TAA或APAP诱导的谷胱甘肽（GSH）耗竭和肝细胞损伤通过氧化应激诱发的炎症导致广泛的肝坏死。SCM-198恢复了肝组织中的GSH水平，减少了肝组织坏死面积。此外，SCM-198不仅减少了F4/80+巨噬细胞的浸润，还降低了血清IL-1β和TNF-α的水平，研究结果表明SCM-198能够减轻ALF小鼠的局部和全身炎症。与生理盐水组相比，SCM-198还能够增加肝组织中Ki67+细胞的数量，减少TUNEL+凋亡细胞数量。这表明SCM-198启动了小鼠ALF后的肝组织损伤修复反应。
为寻找SCM-198的作用靶点，研究团队合成了无毒副作用的FITC化SCM-198探针和生物素化SCM-198探针，利用超高分辨率液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术，筛选鉴定到AdipoR2是潜在的SCM-198结合靶蛋白。通过差异扫描荧光（DSF）、微尺度热泳动（MST）和表面等离子共振（SPR）等进一步证明AdipoR2是SCM-198的结合靶点。
图1.AdipoR2是SCM-198的直接结合靶标
为了更深入地了解SCM-198与AdipoR2相互作用的分子基础，作者进行了分子动力学模拟和超高分辨率LC-MS以鉴定AdipoR2中的关键结合残基。鉴定得到AdipoR2（Y274）、AdipoR2（R278）、AdipoR2（R331）和AdipoR2（R335）是AdipoR2与SCM-198潜在的结合位点。研究团队在获得了点突变蛋白的基础上，通过SPR分析确认AdipoR2（R335）在SCM-198直接结合AdipoR2过程中起了关键的作用。结果表明R335是SCM-198修饰的AdipoR2的主要残基。
接下来作者为探究了AdipoR2介导SCM-198促进ALF小鼠肝脏损伤修复的分子机制。团队使用Adipor2-/-小鼠，构建TAA或APAP诱导的ALF小鼠模型确认AdipoR2是SCM-198在体靶点，研究结果显示，SCM-198治疗性给药与生理盐水治疗性给药不再显示出显著差异。这个结果证明，AdiopR2对介导SCM-198的作用是必需的，在快速促进ALF小鼠肝脏损伤修复过程中起关键作用。
图2.AdipoR2缺陷消除了SCM-198对ALF模型的保护作用
NO是组织修复和再生中的重要信号分子，NO缺乏会损害切除术后的肝脏再生，适度的NO水平对于部分肝切除术后的肝脏再生至关重要。因此，作者探讨了SCM-198对NO产生的影响。结果表明，SCM-198通过AdipoR2信号通路调节NO水平。为了确定哪些NOS介导SCM-198处理的肝细胞中NO的产生，在肝细胞中过表达AdipoR2。发现过表达AdipoR2可增加磷酸化的NOS3（pS1177），其是NO合成关键的NOS3磷酸化形式。
接下来作者探索SCM-198如何转导AdipoR2信号以在受伤的肝脏中产生NO，LC-MS分析显示，除NOS3外，CaM也被SCM-198-生物素探针拉低。有研究表明，NOS3活性可以受Ca2+/钙调蛋白（CaM）/CaMKII的调节，并且CaM可以与NOS3结合。作者通过免疫共沉淀证明AdipoR2通过直接结合正常和受伤肝脏中的CaM和NOS3与已知的产生NO的CaM-CaMKII-NOS3复合物相互作用，并且AdipoR2的细胞内片段（AdipoR21-146）结合NOS3的C端部分。为了确认SCM-198对NO产生的影响是由CaM和CaMKII介导的，使用了CaM拮抗剂R24571和CaMKII抑制剂KN93，研究表明SCM-198的活性依赖于Ca2+/CaM-CaMKII激活。作者也证明了AdipoR2-CaM-CaMKII-NOS3复合物介导SCM-198上调肝细胞NO生成水平，发挥快速促进ALF小鼠肝脏损伤修复作用。
图3.AdipoR2-CaM-CaMKII-NOS3复合物的鉴定
然后作者对SCM-198快速发挥作用的分子基础进行了探索，发现AdipoR2（Y274）是AdipoR2调控肝细胞胞外Ca2+内流的关键位点。其中肝损伤会降低 AdipoR2/CaM/CaMKII-NOS3复合物的活性。而SCM-198通过与AdipoR2结合，促进Ca2+内流，增加CaMKII-NOS3活性和NO产生。
为了探索SCM-198是否可以用于严重感染和炎症引起的ALF，使用了脂多糖（LPS）/D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）诱导小鼠急性肝损伤模型。结果显示SCM-198降低了血清IL-1β和TNF-α水平，减弱异常脂质积累和过氧化、血清GSH水平升高（和肝组织中NO含量。SCM-198还增加了磷酸化CaMKII（pT286）和NOS3（pS1177）的水平。SCM-198增加PCNA和Bcl2的表达，但抑制Bax的表达。这些结果表明，SCM-198激活AdipoR2信号也可以治疗小鼠炎症ALF模型。
最后，利用人肝类器官（HLO）来探索SCM-198治疗人ALF的潜力，结果表明，SCM-198在HLO中的作用与在小鼠肝脏中的作用相似，从而提高了SCM-198治疗人ALF的治疗潜力。
总之，本文鉴定出AdipoR2是SCM-198的特异性结合伴侣，即SCM-198与AdipoR2的结合诱导Ca2+内流，增强CaMKII和NOS3磷酸化并迅速增加NO的产生。NO通过减少炎症介质的产生来介导SCM-198的保肝作用。AdipoR2或NOS3的功能丧失都消除了SCM-198在TAA / APAP ALF小鼠中的保护作用，证明了该复合物对SCM-198在ALF中的保肝功能的重要性。
本文作者：LWH
责任编辑：CT
全文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-55295-7
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