肝细胞癌(HCC)是全球第六大常见癌症发病率和第三大癌症死亡原因。细胞周期扰动通常与癌发生和恶性转化相关，并且是癌症的一个已知特征。 经典的细胞周期法包括使用紫杉醇和Palbociclib，已被FDA批准用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等。然而，它们对HCC的影响仍不清楚。
近日，香港大学黄泽蕾教授团队在JCI insight发表的题为“细胞周期抑制剂激活缺氧诱导的DDX41-STING通路介导肝癌抗肿瘤免疫反应”的文章，研究揭示了细胞周期抑制剂的免疫介导的肿瘤抑制特性，并建议与免疫疗法联合治疗作为一种潜在的治疗方法。
癌症基因组图谱数据显示，TUBB、AURKB、CDK4和CDK6的基因表达水平均上调。而HCC患者中这些细胞周期蛋白的表达水平与总体生存率和无病生存率呈负相关。这表明细胞周期蛋白通过促进细胞生长和增殖在HCC发展和患者总体生存中的重要性。之后通过流式细胞术监测细胞周期概况发现大多数但不是全部抗有丝分裂剂导致细胞中基因组不稳定性的积累。使用γ-H2A.X作为DNA损伤标记来检查发现抑制剂诱导了细胞中的 DNA损伤。qPCR数据显示，药物处理后细胞质中检测到的gDNA含量显着增加，同时进一步实验结果证实细胞凋亡对于胞质 gDNA的积累至关重要，并表明它是胞质gDNA的主要来源。
细胞周期抑制剂诱导细胞衰老和 SASP分泌 当细胞进入永久性生长停滞并变得不增殖时，就会发生衰老。因此作者通过检测细胞中衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)发现细胞周期抑制剂会诱导细胞形态变得扁平且增大，表明细胞在所有抑制剂存在下经历衰老。而RNA测序检测了不同抑制剂作用下细胞中SASP的mRNA水平的数结果说明所有抑制剂均促进不同SASP的表达。四种抑制剂中，CCL2的表达增加最多，因此在后面的实验中，以CCL2作为SASP的代表。
据报道，DNA传感器DDX41能够感知胞质DNA并激活STING-TBK1-IRF3/7途径以诱导SASP表达。因此，作者通过敲低该途径中的主要成分来确定该途径是否用于细胞周期抑制剂治疗。qPCR和ELISA数据均表明DDX41、STING1、IRF7和RelA的KD消除了CCL2的表达。同时，流式细胞术数据表明，在 MHCC97L和CLC4细胞周期抑制剂处理后，STING和IRF3发生磷酸化。而WB数据表明，细胞周期抑制剂以时间依赖性方式引起STING二聚化。因此证明，细胞周期抑制剂引起细胞质中DNA的积累，从而触发DDX41激活STING-TBK1-IRF3/7途径以启动SASP分泌。
TCGA数据显示，DDX41的上调与HCC患者较差的总生存期相关。 高DDX41水平还与较高的Buffa和Winter缺氧评分相关，表明DDX41可能与缺氧相关。由于大多数缺氧事件是由缺氧诱导转录因子1（HIF-1）调节的，HIF-1主要由HIF-1α和HIF-1β组成，因此作者验证了缺氧诱导的DDX41表达是否受HIF调节。MHCC97L细胞中HIF1A和HIF1B的敲除（KO）抑制了缺氧条件下DDX41的上调。NTC和缺氧条件下DDX41的表达上调与CLC2中含氧量正常的条件相比，敲低(KD)组，与NTC对照相比，CLC2和CLC4 HCC细胞系中HIF1A的KD在缺氧条件下也会损害DDX41的表达。为验证DDX41是否是HIF的直接直接作用蛋白。在 DDX41的启动子区域发现了五个假定的缺氧反应元件（HRE），并被设计为由三个引物对覆盖。 染色质免疫沉淀（ChIP）测定显示，仅在缺氧条件下HIF-1α与DDX41的HRE结合富集。WB结果也证实了缺氧条件下DDX41蛋白表达增强。这些结果表明DDX41的表达在缺氧条件下通过HIF-1α和HIF-1β直接调节。
为了验证细胞周期抑制剂是否普遍诱导SASP表达引发免疫反应，使用C57BL/6N免疫活性小鼠进行体内实验。结果显示三种细胞周期抑制剂均显着减小了 HCC肿瘤的大小，且不会导致小鼠体重减轻或产生不良影响。 小鼠 HCC肿瘤的IHC染色清楚地揭示了肿瘤边界内CD4 T细胞、CD8 T细胞和NK细胞染色的显着增加。 一般来说，我们观察到不同治疗组中衰老特征的差异表达。 然而，在紫杉醇/ Palbociclib/ AZD1152治疗后的小鼠中一致观察到SASP诱导的趋势。 这些表明细胞周期抑制剂促进了先天性免疫细胞和适应性免疫细胞向肿瘤核心的浸润。 它们的细胞毒活性也有助于清除癌细胞并随之减小肿瘤大小。 肿瘤免疫监视的激活，为细胞周期抑制剂治疗与免疫治疗相结合，充分释放免疫细胞清除肿瘤的潜力提供了有利条件。此外，抗PD-1与细胞周期抑制剂联合给药生存结果表明，未治疗和单一治疗之间的总生存期差异很小，但紫杉醇加ICI组的联合治疗显着延长了患有HCC的小鼠的总生存期。AZD1152和Palbociclib加ICI组往往会提高小鼠的总体生存率。同时观察到紫杉醇延长了 StingWT HCC小鼠的生存期，而StingKO HCC中的趋势不太明显，但是这组紫杉醇对StingWT HCC和StingKO HCC效果的数据尚未达到统计学显着性。 因此，它不能提供细胞周期抑制剂激活STING的直接证据。 然而，数据表明细胞周期抑制剂部分通过STING产生抗肿瘤作用。
总的来说，本研究证明细胞周期抑制剂除了阻止细胞周期外还具有抗癌功能。其持续引起胞质 DNA积累和DNA损伤，触发胞质DNA传感器DDX41并激活STING分泌SASP。同时发现DDX41是HIF的转录靶标，在缺氧条件下 HCC细胞在STING激活和SASP产生中对抗有丝分裂剂更加敏感，其中 SASP触发肿瘤中的免疫细胞浸润以清除癌症。
本文作者:TJH
责任编辑:LQY
全文链接：https://doi.org/10.1172/jci.insight.170532.
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