肝脏具有强大的再生能力，急性肝损伤后可恢复原始质量和功能，但慢性肝损伤常导致肝纤维化，影响肝脏功能和再生。肝纤维化在非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝癌等慢性肝病中普遍存在，目前缺乏有效治疗方法和临床批准的抗纤维化药物,寻找能同时调控肝再生与纤维化的关键靶点意义重大。研究表明，肝内血管的分子信号在肝再生与纤维化之间起重要作用，而肝星状细胞（HSCs）在此过程中扮演关键角色。慢性肝损伤中，活化的HSCs可通过TGF-β信号通路促进纤维化，而在急性肝损伤中则释放促再生因子HGF等刺激肝细胞增殖。公开的单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示了HSCs的不同亚群，分别参与肝脏再生和纤维化的调控，尚不清楚HSCs抑制纤维化并促进再生的具体调控靶点。
近日，Hepatology发表了文章“Lhx2 Specifically Expressed in Hepatic Stellate Cells Promotes Liver Regeneration and Inhibits Liver Fibrosis”。该研究发现转录因子Lhx2在肝再生与纤维化中起双重调节作用，通过肝细胞生长因子HGF的表达上调促进肝细胞增殖，同时促进SMAD6阻断TGF-β信号通路抑制HSCs的激活。该研究阐明了Lhx2的机制，为慢性肝病的治疗提供了潜在靶点。
图1.肝星状细胞特异性表达Lhx2可促进肝再生，抑制肝纤维化
为研究肝再生与纤维化之间的分子联系，研究人员通过注射四氯化碳（CCl4）建立了急性和慢性肝损伤模型，并在多个时间点采用天狼星红染色和免疫组化染色评估肝纤维化和肝再生。结果显示，慢性损伤模型出现明显纤维化，而急性损伤模型则无明显纤维化。慢性损伤后，肝细胞增殖显著低于急性损伤后的恢复期。为探讨HSCs在肝再生与纤维化中的作用，研究者从CCl4诱导的肝损伤模型中分离原代HSCs进行RNA测序。比较基因表达谱发现，急性模型中有505个高表达基因，主要为促再生因子，而慢性模型中有1202个特异性表达基因，主要与纤维化相关。进一步分析急性模型中高表达的23个转录因子可能促进再生，而慢性模型中的79个转录因子则与纤维化相关。其中，转录因子Lhx2在急性损伤后显著上调，而在慢性损伤中则表达降低，其与肝再生和纤维化的相互作用表明其作为潜在靶点的意义重大。
图2.急性和慢性肝损伤后肝星状细胞表达的变化
接着，研究者在LX2HSC细胞系中进行了gain-of-function实验，以确定LHX2的靶点。实验显示，Lhx2过表达使442个基因上调、640个基因下调，上调基因与细胞增殖、再生及肝脏发育相关，下调基因涉及细胞外基质（ECM）组织、趋化性调控与细胞迁移。CUT&Tag分析表明Lhx2结合峰主要位于调控区，发现新基序“TGA[G/C]TCA”及已知基序“CTAATTA”，前者主要调控ECM相关基因。结合RNA-seq及CUT&Tag数据显示Lhx2可上调HGF等促再生因子，下调COL3A1等纤维化相关基因，影响HSCs功能从而促进肝再生并缓解肝纤维化。
图3.RNA-seq和CUT&Tag检测HSC中LHX2的调控靶点
为评估Lhx2对肝脏再生的调控作用，本研究使用胆固醇和甲基化修饰的siRNAs在CCl4诱导的急性肝损伤模型中敲低Lhx2的表达。结果显示，Lhx2仅在HSC中表达，si-Lhx2小鼠中的Lhx2表达显著减少。免疫组化和HE染色表明，敲低Lhx2的小鼠在急性肝损伤后肝功能恢复较慢，坏死面积较大，巨噬细胞浸润增加。此外，Lhx2敲低小鼠在损伤后2和3天增殖细胞减少，血清白蛋白和总蛋白水平显著降低。为研究Lhx2在HSC中的特异性作用，研究者向Lrat-Cre小鼠注射AAV8-DIO-mLhx2病毒，构建HSC特异性Lhx2过表达。肝组织分析显示，Lhx2过表达小鼠的坏死区域和巨噬细胞浸润显著减少，增殖和有丝分裂细胞数量显著增加，血清白蛋白和总蛋白浓度也较高。总之，这些结果表明Lhx2促进急性肝损伤后的肝脏再生和肝功能恢复。
为阐明Lhx2对肝脏再生的调控机制，本文首先研究了Lhx2过表达的HSC对肝细胞增殖的影响。将野生型、对照（PCDH）和过表达Lhx2的LX2上清液添加到人肝细胞HL7702中，结果显示，Lhx2过表达的LX2上清液显著促进了肝细胞增殖，Ki67免疫荧光进一步证实了这一结果。结合RNA-seq和CUT&Tag数据分析发现，促再生因子HGF和NTF3在Lhx2过表达的LX2中显著增加。而HGF被认为是促进肝脏再生的关键因子。实验中，Lhx2过表达的LX2分泌的HGF蛋白水平显著升高，而HGF受体抑制剂SU11274显著降低了肝细胞增殖。在小鼠原代HSC也验证了Lhx2过表达同样显著促进Hgf表达，而HGF启动子中存在开放的染色质区域可能与LHX2结合。双荧光素酶报告基因检测也证实了LHX2与HGF启动子之间的相互作用。这些结果验证了LHX2主要通过转录调节HSC中的HGF，促进肝细胞增殖。
图4.HSCs中LHX2的表达可调节肝细胞增殖
为探究Lhx2在肝纤维化中的作用，研究者使用HSCs中特异性过表达Lhx2小鼠构建慢性肝损伤模型。对照组和Lhx2过表达小鼠分别注射12次CCl4以诱导肝纤维化。结果显示，Lhx2过表达小鼠的ALT和AST水平显著降低，肝损伤有所改善。此外，Lhx2过表达组的肝脏坏死区域更小，纤维化程度降低，巨噬细胞浸润减少。肝组织中总羟脯氨酸含量也显著降低，纤维化相关基因（如Acta2和Col1a1）的mRNA水平明显下降。增殖细胞比例增加，Hgf和Pcna蛋白水平上升，而CollagenI和Desmin蛋白降低。这些结果表明，Lhx2在慢性肝损伤中抑制了肝纤维化，促进了肝再生。
HSCs的持续激活常导致肝纤维化，研究者通过HSC细胞系LX2研究LHX2是否能抑制HSC激活。Lhx2过表达的LX2细胞呈现圆形结构，异于对照的成纤维细胞样细胞形态；且抑制激活相关基因COL1A1、COL3A1和ACTA2的mRNA和蛋白表达。免疫荧光染色显示，LHX2过表达显著抑制了原代小鼠HSC和LX2细胞的激活。CCK8检测表明，LHX2过表达显著抑制LX2细胞的增殖。RNA-seq和CUT&Tag分析表明，LHX2下调的基因在间充质细胞迁移中富集，划痕实验证实LHX2过表达的LX2细胞迁移速度较慢。相反，Lhx2基因敲低增强了HSC激活和迁移。综上所述，LHX2抑制了HSC的激活、增殖与迁移，进而可能减轻肝纤维化。
TGF-β信号通路在HSC的激活中扮演关键角色。研究者发现在TGF-β刺激下，HSC中的LHX2表达显著下调，LHX2对TGF-β信号通路具有抑制作用，包括上调SMAD6的表达。LHX2不仅促进了SMAD6的表达，Westernblots结果验证其还抑制了SMAD2的磷酸化，进一步的实验表明LHX2结合到SMAD6的启动子区域，从而增强其转录。使用siRNA敲低SMAD6导致HSC激活相关基因（如COL1A1、ACTA2和COL3A1）显著上调，说明LHX2通过上调SMAD6抑制HSC激活。然而，HGF的表达未受SMAD6敲低的影响，表明LHX2调节HGF的表达与SMAD6无关。综上，LHX2通过转录上调SMAD6来抑制HSC的激活。
图5.LHX2对TGF-β信号通路的调控作用
综上，该研究证实Lhx2在肝再生与纤维化进程中起关键作用，通过调控HSCs功能、影响相关信号通路与基因表达，促进肝脏再生、抑制纤维化，为肝脏疾病治疗提供极具潜力的新靶点，未来可深入探索基于Lhx2的靶向治疗策略，有望改善肝脏疾病预后。
本文作者：HWY
责任编辑：CT
全文链接：
https://journals.lww.com/hep/abstract/9900/lhx2_specifically_expressed_in_hepatic_stellate.1115.aspx#
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