类风湿性关节炎（RA）是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，以滑膜增生、骨破坏和关节畸形为特征。早期诊断和干预是RA临床管理的必要策略。探索类风湿关节炎早期免疫细胞功能障碍的具体机制，对阐明炎症机制、筛选干预靶点具有重要的科学意义和临床价值。
肠屏障协调营养吸收、细菌共生和免疫系统肠屏障的完整性被认为影响炎性关节炎的发展，提示肠道病理学与关节炎之间存在联系在类风湿性关节炎（RA）的临床前阶段观察到以异常免疫细胞浸润和生态失调为特征的肠道病理学。单层肠上皮细胞（IEC）由紧密连接连接并包裹在粘液中，构成了这一机械屏障的关键部分。（“肠漏”）、自身免疫和全身性炎症可能会出现。5因此，维持肠屏障的完整性，例如，通过靶向紧密连接蛋白，减轻炎性关节炎。然而，IEC存活在炎性关节炎发展中的作用目前尚不清楚。
为了确定在CIA过程中IEC的完整性，研究者将肠道细菌移位描述为屏障功能障碍的宏观证据，使用细菌特异性探针进行FISH，细菌易位可以检测到在回肠前不久（第29天pfi）和CIA发作时（第36天pfi）通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色检测回肠IEC的死亡。和电子显微镜。然而，在结肠中没有显示出细菌易位或细胞死亡的显著增加。为了阐明起作用的细胞死亡机制，在关节炎发作时（pfi第36天）分离来自小肠的IEC，并通过大量RNA测序进行分析。 火山图和基因本体（GO）富集分析表明，在关节炎发作时，凋亡途径发生了显著变化。在差异表达的基因中，与非关节炎对照组相比，关节炎小鼠的IEC中的Caspase-3、Caspase-8、Ripk 1、Ripk 3和Mlk 1基因显著增加。 通过qRT-PCR分析证实了这些结果。和免疫荧光，表明切割的胱天蛋白酶-3和8的上调。以及参与坏死的关键蛋白质，如关节炎发作时IEC中的p-RIPK 1、p-RIPK 3和p-MLKL，表明在关节炎发作时IEC的大量死亡。
研究结果2：肠上皮细胞HIF 1α表达控制关节炎的发生
为了鉴定增加的坏死性凋亡标志物和关节炎之间的假定分子相关性，研究者进一步分析了从IEC批量RNA测序获得的京都基因和基因组百科全书（KEGG）途径富集结果。在关节炎发作时，IEC中的T细胞分化途径和HIF 1 α途径显著增强。 新发RA患者回肠活检组织中HIF 1 α的免疫荧光染色显示，与健康对照组相比，IEC中HIF 1 α的表达增加。同样，在CIA发病时，（第36天PFI），而在鼠模型中蛋白质表达甚至更早升高（第20天pfi;图2C-E）。为了分析HIF 1 α在肠上皮中的功能，研究者产生了IEC特异性HIF 1 α敲除小鼠，（Hif 1a ΔIEC）。使用Villin-cre报道了绒毛蛋白基因在IEC中的选择性表达; Rosa 26 tdTomato幼稚小鼠随后，在来自Hif 1a ΔIEC小鼠的IEC中通过qRT-PCR和蛋白质印迹证实了IEC中90%的HIF 1 α敲除效率。有趣的是，Hif 1a ΔIEC小鼠在CIA中表现出更严重的和较早发病Hif 1a ΔIEC小鼠表现出增加的爪厚度。骨质侵蚀、滑膜炎症和破骨细胞数量IFN-γ和IL-17 A血清水平在Hif 1a ΔIEC小鼠中增加。以及派伊尔斑、肠系膜淋巴结和脾脏中的Th 1和Th 17细胞数量。总之，这些结果表明，在IEC中HIF 1 α表达对关节炎的发展具有保护作用。
图2. 肠上皮细胞HIF 1α表达控制关节炎的发生
研究结果3：诱导HIF1α缓解关节炎并抑制肠上皮细胞死亡
为了进一步研究HIF 1 α在关节炎中的作用，研究者用roxadustat处理小鼠，其通过抑制PHD蛋白来稳定HIF表达。与溶剂处理相比，Roxadustat处理（每隔一天口服灌胃）降低了临床评分和关节炎的发生率。 爪肿胀、滑膜炎症、骨质侵蚀和破骨细胞数量趋于减少。在罗沙司他治疗的CIA小鼠中，肠道炎症受到抑制，如炎症区域减少和肠道细菌移位所示。除脾脏外，来自PP和MLN的淋巴细胞的流式细胞术分析显示，在罗沙杜司他处理的CIA小鼠中，Th 1和Th 17细胞浸润减少，这与较低的血清IFN-γ和IL-17 A水平有关伊加+B220细胞在PP中减少，但在MLN或脾中没有减少。而Treg细胞在PP和MLN中增加，表明在罗沙杜司他处理的CIA小鼠的肠道中诱导免疫调节环境。接下来，研究者检测了roxadustat是否改变了IEC中HIF 1 α和HIF 2 α的表达，虽然对HIF 2α没有显著影响，但HIF 1α蛋白水平显著增加。TUNEL染色和电子显微镜扫描证实，roxadustat保护IEC活力。经roxadustat处理后，Bax和Bcl-2的表达保持不变。为了研究HIF 1 α参与细胞死亡途径，研究者用肿瘤坏死因子α（TNFα）和各种Toll样受体激动剂刺激WT和HIF 1 α缺陷型类器官24小时，与WT类器官相比，HIF 1 α缺陷类器官在TNFα刺激后显示出降低的活力。有趣的是，罗沙司他治疗仅显示出对WT类器官中TNFα诱导的细胞死亡的缓解作用。 总之，这些数据表明，稳定IEC中的HIF 1α可支持其存活，维持肠屏障功能并改善关节炎。
图3. 诱导HIF1α缓解关节炎并抑制肠上皮细胞死亡
研究结果4：HIF 1 α表达可保护肠上皮细胞免于死亡
值得注意的是，HIF 1 α缺乏在稳态下不影响肠道完整性，如肠道组织学所示。P然而，在CIA的情况下，回肠的组织学切片显示增加的炎症和细菌入侵与同窝对照小鼠相比，Hif 1a ΔIEC的粘液分泌没有显著变化。和电子显微镜观察显示Hif 1a ΔIEC CIA小鼠中上皮细胞死亡增加接下来，研究者在关节炎发作时从未诱导和CIA诱导的WT和Hif 1a ΔIEC小鼠中分离IEC而来自未诱导的WT和Hif 1a ΔIEC小鼠的IEC显示出非常相似的mRNA表达谱，CIA期间WT和Hif 1a ΔIEC小鼠之间有1837个基因差异表达。GO和KEGG富集分析表明，HIF 1 α缺失影响控制T细胞活化和增殖的基因，证实了研究者先前的荧光激活细胞分选分析关于细胞死亡，胱天蛋白酶-3 mRNA表达下调，而在CIA诱导的小鼠Hif 1a ΔIEC中，坏死性凋亡基因Ripk 3表达上调通过蛋白质印迹证实了这两种变化。示出了切割的胱天蛋白酶-3和切割的胱天蛋白酶-3和磷酸化的RIPK 3（p-RIPK 3）的免疫荧光。为了进一步证实HIF 1α和坏死性凋亡标志物之间的相互依赖性，在缺氧条件下，在肠上皮细胞系MC 38中通过shRNA沉默HIF 1α。 当在MC 38细胞中敲低HIF 1α时，观察到坏死性标志物（RIPK 1、RIPK 3和MLKL）增加和凋亡标志物（裂解的半胱天冬酶-3和裂解的半胱天冬酶-8）减少。因此，在敲低HIF 1α后，MC 38细胞显示出坏死增加和凋亡减少。总的来说，这些数据表明HIF 1α是IEC中坏死性凋亡的负调节因子。
图4. HIF 1α表达可保护肠上皮细胞免于死亡
文章总结：关节炎发生时IEC发生凋亡和坏死性细胞死亡，导致肠屏障功能受损，HIF 1α是关节炎发生时IEC中表达上调最多的基因之一。 在IEC中，HIF 1α的缺失增强了IEC的坏死性凋亡，引发肠道炎症并加重关节炎。HIF 1α被发现是坏死性凋亡诱导因子RIPK3的关键转录抑制因子。 在新发类风湿性关节炎患者的肠上皮中也发现了RIPK3表达增强，表明坏死性凋亡。稳定HIF 1 α以及基于小分子的RIPK3抑制剂在体外和体内挽救了肠坏死性凋亡，并抑制了关节炎的发展。本研究结果确定IEC坏死性凋亡是肠道和关节炎发展之间的关键联系。
本文作者： HHK
责任编辑：TJY
全文链接：
https://doi.org/10.1016/j.redox.2024.103401
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