类风湿性关节炎（RA）是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，以滑膜增生、骨破坏和关节畸形为特征。早期诊断和干预是RA临床管理的必要策略。探索类风湿关节炎早期免疫细胞功能障碍的具体机制，对阐明炎症机制、筛选干预靶点具有重要的科学意义和临床价值。
中性粒细胞在类风湿关节炎的发病和发展中起着至关重要的作用。它们是人类中最丰富的循环白细胞，具有强大的先天免疫反应。中性粒细胞在类风湿关节炎中的致病作用在于改变了使炎症持续存在并导致受影响关节软骨和骨破坏的几个过程，如细胞存活和迁移能力增加、炎症活性异常、活性氧（ROS）产生升高和中性粒细胞细胞外陷阱（NETs）释放加剧。在RA患者中，研究者发现中性粒细胞比健康人具有更强的促炎表型，并伴有明显的ROS特征。然而，ROS可能的双向作用是否与中性粒细胞或中性粒细胞中的NOX2复合物的功能有关尚未被阐明。
研究结果:1. 特定中性粒细胞群的ROS代谢过程在实验性关节炎的发展中至关重要
BM是造血的主要部位，负责产生包括中性粒细胞在内的所有类型的血细胞，对于了解中性粒细胞在RA中的发育和功能至关重要。为了表征免疫启动和关节炎发病期间的中性粒细胞，研究者对1)初始，2)免疫启动（第0天）和3)免疫增强（第21天重复COL2免疫）即关节炎发病期间的BM细胞进行了scRNA-seq分析。总共分析了72388个细胞，根据典型标志物的表达确定了10个不同的簇，包括B细胞、浆细胞、造血干细胞、ProEryth、红母细胞、GMP、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、T细胞和MPs（图1A和B，S1A和B）。其中，中性粒细胞的比例在未处理组和引物组之间有显著差异（图1C和D）。可能是因为增强小鼠的中性粒细胞更有效地募集到炎症部位，这表明中性粒细胞从BM迁移到组织而不通过血管室（图1C和D）。研究者用抗ly6g抗体耗尽DBA1/J小鼠的中性粒细胞，随后用COL2免疫它们，发现只有中性粒细胞耗尽的小鼠发展为轻度关节炎。这表明中性粒细胞可以防止小鼠在CIA早期发展为关节炎（图1E和F）。研究者还发现G4亚群高表达Ncf1，Ncf1是NOX2复合体的重要亚基，负责诱导ROS，进一步支持中性粒细胞ROS的产生主要是由吞噬NADPH氧化酶在关节炎前期介导的（图1I和J）。
研究结果2：活性氧在实验性关节炎的发展中显示出双重作用
为了探索NOX2复合体的NCF1组分在关节炎不同阶段产生的ROS的作用，研究者用一般的NOX抑制剂DPI治疗小鼠以阻断ROS的产生。DPI（100 ng/kg/天）治疗开始于第0天启动前（D0）（启动）或在第21天增强后（发病）关节炎发作前（图2A）。有趣的是，在启动（D0）之前开始的每日DPI治疗导致关节炎的发展，在D42时出现肿胀，关节炎评分和滑膜增生的严重程度（图2B-E）。研究者检测了不同时间点PB中中性粒细胞的数量和数量。免疫后21天，小鼠PB中性粒细胞中ROS水平升高。DPI可以通过抑制中性粒细胞ROS水平增加小鼠PB中性粒细胞，与启动小鼠相似，并且在D14时中性粒细胞水平最高（图2F和G）。研究者进一步通过流式细胞术检测了D14时小鼠BM、关节和脾脏中的中性粒细胞。这些结果表明，DPI在启动小鼠中增加的血液中性粒细胞可能来自BM在启动阶段，这可能有助于关节炎的早期发作。这一阶段ROS水平非常高的原因可能是来自非nox2依赖性途径的ROS也参与了关节炎的最严重阶段。然而,增强组加入DPI治疗21-42天后，与非治疗组相比，减少临床评分(图2 h和I),以及膝关节滑膜增生的D42(图2 j和K)。综上所述，这些结果表明，在免疫启动过程中，ROS的丢失导致关节炎的发展，关节中中性粒细胞数量增加。相反，在关节炎发病期间，ROS的缺失通过减少中性粒细胞数量来缓解关节炎症状，提示ROS双向调节关节炎。
研究结果3：ROS缺乏通过在早期募集中性粒细胞引发关节炎
诱导活化NOX2复合体是中性粒细胞ROS的主要来源，另外一小部分来自线粒体。为了评估不同来源的ROS在早期CIA中的作用，研究者使用了nox2特异性抑制剂GSK2795039和线粒体ROS抑制剂MitoQ10。研究者每天用GSK2795039或MitoQ10处理小鼠，直到实验结束时在D0用COL2免疫（图3A）。一次免疫的小鼠，如果给予NOX2或线粒体ROS抑制剂（图3B和C），就会患上关节炎（图3B和C）。此外，观察到NOX2或线粒体ROS抑制剂的小鼠关节中中性粒细胞水平较高，其中NOX2抑制剂组中性粒细胞数量最多（图3C）。因此，抑制NOX2复合物衍生的ROS比抑制线粒体衍生的ROS更有效地促进关节炎（图2B、G和3B）。这些结果表明，抑制nox2来源的ROS后，引物小鼠对关节炎的易感性更高，表明中性粒细胞来源的ROS是一个重要的调节因子。接下来，研究者在Ncf1基因敲除的C57BL/6J小鼠（Ncf1 ko）中建立了一个早期关节炎模型。注射LPS后，仅在Ncf1-/-中观察到关节肿胀，而在WT小鼠中没有观察到关节肿胀（图3E和F）。启动Ncf1-/-小鼠在无关节炎评分的D14上具有ROS缺乏的中性粒细胞和表达cxcr2的细胞水平升高，之后小鼠在D35的实验终点发生关节炎（图3G-J），并且具有ROS缺乏的其他细胞（巨噬细胞、单核细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞）的比例低于WT小鼠（图3G-J）。令人难以置信的是，研究者发现了两个CD4+ T细胞群，CD4+ T细胞-1和CD4+ T细胞-2，它们的ROS水平有显著差异。当关节炎发生时，在D35时，WT小鼠BM中中性粒细胞的数量高于Ncf1-/-小鼠。中性粒细胞的数量在Ncf1-/-小鼠中更高，特别是在BM外，表明从BM中动员Ncf1缺陷的中性粒细胞增加（图3K和图S3F）。总的来说，这些结果表明，实验性关节炎早期阶段的ROS缺乏促进中性粒细胞表现出促炎特性，促进关节炎的发展。
研究结果4：ROS缺乏会影响中性粒细胞的功能
中性粒细胞活力与中性粒细胞氧化爆发活性密切相关，而中性粒细胞氧化爆发活性负责ROS的产生。在ROS和ROS抑制剂存在30分钟的情况下，PMA或fmlf刺激的中性粒细胞产生的ROS以剂量依赖性的方式被抑制（图4A和S4B）。NOX2产生的ROS大约是线粒体产生的ROS的三倍，（图S4C）。钙动员是调节许多中性粒细胞生物反应所必需的。进一步探索ROS与钙通量之间的相关性，研究者观察到ROS抑制剂以剂量依赖的方式下调PMA或fMLF触发的中性粒细胞的钙通量（图4B）。接下来，研究者测试了ROS是否直接引起中性粒细胞的形态变化。PMA刺激30 min后，圆形中性粒细胞变平，呈极化形态，细胞核解聚。DPI阻断了这些变化，但其他抑制剂的作用不明显（图4C和S4G）。在H2O2刺激后，中性粒细胞发生凋亡和核破裂，而不是PMA刺激2h诱导的NETs（图4C和S4H）。上述结果表明，外源ROS（H2O2）诱导中性粒细胞凋亡，而NOX2衍生的内源ROS参与了中性粒细胞的活化。抑制ROS后，中性粒细胞粘附减少，迁移和浸润增加（图4D-F）。研究者还观察到Ncf1¶/¶中性粒细胞的迁移增强（图4G）。在吞噬作用方面，NCF1的功能性敲除以及药理抑制均降低了大肠杆菌在ros缺陷中性粒细胞中的吞噬作用（图4H和S4I）。趋化受体和炎症细胞因子在中性粒细胞募集和炎症反应的传播中起重要作用。因此，研究者评估了ROS与中性粒细胞趋化受体和炎症细胞因子的相关性。成熟度分析显示，fMLF刺激12小时后，ROS减少的中性粒细胞CXCR2和Ly6G的表达增加（图4I）。这些缺乏ros的中性粒细胞可能表现出中性粒细胞成熟过程的增加，寿命长，细胞凋亡少，吞噬能力弱。此外，它们可能含有毒性较小的颗粒。因此，这些结果表明，ros缺陷中性粒细胞不具有经典的促炎表型。
文章总结：本研究是对传统研究的补充，首次探讨了中性粒细胞ROS在不同炎症阶段的作用。基于ROS效应分子检测和治疗中性粒细胞的新策略的发展将为RA和其他自身免疫性疾病的早期干预和治疗提供有效和安全的指导。
本文作者：HHK
责任编辑：TJY
全文链接：https://doi.org/10.1016/j.redox.2024.103401
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