泛素化是一种可逆的翻译后修饰，受E3泛素连接酶和去泛素化酶（DUB）的调控。泛素特异性蛋白酶25（USP25）是一种去泛素化酶，它能从选定的底物蛋白上移除多聚泛素链，使其免受蛋白酶体的识别和降解。有多项研究表明，去泛素化酶介导的去泛素化过程与结肠炎症的发生和发展密切相关。有基因组测序研究表明，UC患者结肠黏膜中USP25的表达水平低于健康个体。然而，USP25在UC中的发病机制仍需进一步研究。
信号转导及转录激活因子3（STAT3）在调节炎症和免疫反应方面发挥着重要作用。有研究表明，小鼠体内STAT3缺乏会引发结肠炎。STAT3的磷酸化激活可介导抗炎因子IL-10/IL-22的产生，从而抑制炎症性肠病中的肠道炎症。此外，STAT3磷酸化会促进肠上皮再生，且可上调结肠炎小鼠紧密连接蛋白的表达，从而促进肠道屏障完整性。既往研究表明，STAT3在UC的发病机制中起重要作用，而STAT3会受去泛素酶USP28的调节。然而，目前尚无关于USP25在结肠炎中对STAT3表达调控的研究。
近日，发表在Cell Death & Disease上题为“Ubiquitin-specific protease 25 ameliorates ulcerative colitis by regulating the degradation of phosphor-STAT3”的文章，揭示了USP25可以通过促进STAT3的去泛素化，特别是K48连接的在p-STAT3Y705的赖氨酸409位点的去泛素化，减少STAT3降解，从而保护肠道黏膜屏障，缓解炎症。
作者首先通过人源数据集分析及免疫组化结果发现，相对于健康对照组，UC患者结肠中的USP25表达显著降低。该结果在DSS诱导的结肠炎小鼠以及LPS在人结肠上皮细胞系NCM460和Caco-2细胞上诱导的炎症模型上得到相同的印证。接着作者分别在小鼠和NCM460细胞上敲低和过表达USP25，发现USP25敲低在体内和体外均能加重UC中肠道屏障的损伤及炎症损伤，而过表达USP25则能减轻这些损伤。
为了确定介导USP25抑制炎症的具体靶点，作者使用过表达USP25的293T细胞进行了免疫沉淀-质谱（IP-MS）分析。在质谱分析结果中检测到了STAT3、HSP90A和BIP等多种与炎症调节相关的蛋白质。由于先前的研究表明，STAT3在UC的发病机制中起重要作用，作者选择STAT3作为USP25的候选靶点。为了证实USP25与STAT3的蛋白质相互作用，作者在293T细胞中转染了过表达质粒Flag-USP25和HA-STAT3，并通过共免疫沉淀（co-IP）验证了USP25与STAT3之间的蛋白质相互作用。这一结果在人肠上皮细胞NCM460中进一步得到了验证，USP25与STAT3存在相互作用。
图1.USP25与STAT3相互作用
为了进一步探究UC中STAT3的降解以及USP25对STAT3的调节作用，作者在293T细胞中过表达了HA-STAT3后，使用环己酰亚胺（CHX）来抑制蛋白质合成，然后分别使用MG132和氯喹（CQ）来抑制泛素-溶酶体途径和自噬溶酶体途径。WB结果显示，MG132能阻止STAT3的降解，而CQ不能，这表明STAT3蛋白的降解依赖于泛素-蛋白酶体途径。接着作者对敲低或过表达USP25的UC小鼠的结肠组织和NCM460细胞进行了蛋白质泛素化测定，发现USP25促进了NCM460细胞和小鼠肠道组织中STAT3的去泛素化。
为了探究USP25在STAT3泛素化过程中与不同赖氨酸位点的关系，作者将带有不同赖氨酸位点突变的STAT3表达载体（如STAT3-K6R、K11R、K27R、K48R、K63R等）以及USP25表达载体转染入293T细胞中，予以MG132处理，通过IP检测泛素化情况。结果显示，USP25仅无法与K48位突变的K48R-STAT3连接。该结果在USP25表达下调或过表达的NCM406细胞以及Usp25基因敲除小鼠的结肠组织中得到相同的印证，表明USP25主要促进STAT3的K48连接的去泛素化反应。
为了确定USP25催化的潜在赖氨酸位点，作者在293T细胞中分别对STAT3的五个赖氨酸位点（K49、K409、K531、K707、K685）进行突变。IP结果显示，USP25能够促进STAT3-K49R/K531R/K707R/K685R的K48连接的去泛素化；然而，当K409位点突变后，K48连接的去泛素化以及USP25介导的STAT3去泛素化现象消失，这就表明K409位点是USP25催化STAT3去泛素化的关键特异性位点。
图2.USP25促进STAT3的K48连接的去泛素化
接着作者通过免疫荧光和WB发现，p-STAT3的表达在USP25表达下调的NCM460细胞以及Usp25基因敲除小鼠的结肠组织中降低，在过表达USP25的NCM460细胞中增加，而总STAT3的表达未观察到显著差异。此外，使用λ蛋白磷酸酶（λ-PPase）抑制蛋白质磷酸化时，USP25与STAT3之间的相互作用显著减弱；在使用STAT3的磷酸化抑制剂stattic抑制STAT3磷酸化后，p-STAT3的表达降低，且USP25催化的K48连接的STAT3去泛素化减弱。这些结果表明，USP25与p-STAT3存在物理相互作用。
为了进一步证实这种可能性并确定STAT3潜在的磷酸化位点，根据磷酸化位点的预测结果，将四个磷酸化位点（S727、S521、Y705和T516）替换为丙氨酸或苯丙氨酸（S727A、S521A、Y705F和T516A），这些位点无法被磷酸化或激活。与野生型STAT3（STAT3-WT）相比，STAT3-S727A/S521A/T516A的磷酸化未受影响，且STAT3与USP25之间的相互作用也无显著变化。相比之下，STAT3-Y705F的磷酸化显著降低，USP25与STAT3之间的相互作用也明显减弱。此外，在705位酪氨酸突变后，USP25催化的K48连接的STAT3去泛素化作用减弱，STAT3的泛素化增加，这表明USP25催化了K48连接的p-STAT3去泛素化。
图3.USP25减弱磷酸化STAT3的蛋白酶体降解
为了验证STAT3在UC中的作用，作者使用慢病毒shSTAT3干扰NCM460细胞中STAT3的表达后用LPS诱导炎症模型，发现低STAT3表达的细胞中ZO-1和occludin的表达显著降低。另外，作者培育了肠道上皮细胞特异性Stat3基因敲除小鼠后用DSS诱导肠炎模型，发现Stat3缺陷会加重小鼠的DSS诱导性结肠炎。最后作者将表达STAT3的腺相关病毒8（AAV8-STAT3）注射到USP25基因敲除小鼠体内，然后用DSS诱导肠炎，发现STAT3的过表达能够改善USP25敲低加重的肠炎症状。
图4.腺相关病毒过表达STAT3可减轻DSS诱导的USP25基因敲除小鼠的结肠炎
综上所述，USP25可以通过调节p-STAT3的降解来改善UC，是一种特异性的STAT3调节剂，可作为UC的治疗靶点。
本文作者：ZXQ
责任编辑：CT
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https://www.nature.com/articles/s41419-024-07315-z
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