非酒精性脂肪肝（NAFLD）有望超过病毒性肝炎，成为肝癌的主要危险因素。与病毒性肝炎相关肝细胞癌（HCC）不同，营养供应过多在脂肪性HCC中的作用尚不清楚，阻碍了有效的预防和治疗策略。因此，确定脂肪性HCC发病机制中的关键分子，研究脂肪酸（FA） 供应过量引起的代谢重编程变化，了解其分子机制，并寻找潜在的治疗靶点至关重要。
武汉大学中南医院袁玉峰等团队在Cancer Letters上发表题为“RNF5 exacerbates steatotic HCC by enhancing fatty acid oxidation via the improvement of CPT1A stability”的文章，该研究表明RNF5 通过增强脂肪酸氧化，在脂肪酸攻击存在下特异性加重脂肪性 HCC。
为了确定脂肪性 HCC 的关键调节因子，对小鼠和人脂肪性 HCC 组织以及邻近的非肿瘤样本进行了跨物种转录组分析。小鼠和人 DEGs 之间共有的 11 个基因，其中考虑了E3连接酶RNF5，因为E3连接酶具有公认的药物潜力。且WB、Qpcr和免疫荧光等结果表明，RNF5 表达在脂肪变性肝脏样本中降低，在脂肪性 HCC 中表达增加。在癌症基因组图谱肝细胞癌 （TCGA-LIHC） 数据库中，肿瘤 RNF5 表达水平与 HCC 患者的总生存率无关。由于 RNF5 鉴定来源于脂肪性 HCC，因此作者比较了 RNF5 在 HCC 患者队列中脂肪性 HCC 和非脂肪性 HCC 中的预后相关性。在脂肪性 HCC 中观察到 RNF5 表达与总生存期呈负相关，而在非脂肪性 HCC 中未发现相关性。总的来说，这些数据表明 RNF5 是脂肪性 HCC 的关键贡献者。
为了阐明 RNF5 在 HCC 中的作用，作者设计了稳定地过表达或敲除 RNF5的HCC细胞系（Huh7 和 Hep3B）。CCK-8和Transwell检测显示，过表达RNF5 对 HCC 细胞增殖或迁移没有显著影响。但在添加300 μm PA 后显著增强了肿瘤细胞的转移能力，说明RNF5 过表达显著增加了受 PA 刺激的 HCC 细胞的增殖能力。相反，RNF5 敲除显示出相反的效果。随后，在喂食 HFHC 饮食的裸鼠中建立了皮下肿瘤模型，发现 RNF5 过表达组的肿瘤表现出明显大于对照组的体积和平均重量，而 RNF5 敲除则逆转了这些影响。综上所述，这些结果表明 RNF5 在体外高 FA 条件下显著促进 HCC 细胞的增殖、迁移和侵袭。
接下来作者通过AAV8-甲状腺激素结合球蛋白 （TBG） 用于模拟脂肪性 HCC 期间 RNF5 表达的增加，以实现肝脏特异性 RNF5 过表达。通过腹膜内注射 DEN和HFHC 饮食建立脂肪性肝癌模型，与 Ctrl 组相比，RNF5促进脂肪性小鼠的肝癌发生和癌症进展。
为了阐明RNF5 在高脂肪条件下特异性恶化 HCC的潜在机制进行脂质组学分析。结果表明，FAO 在脂肪性 HCC 中具有潜在的重要作用。进行了高通量 RNA 测序分析以确定参与 FA β-氧化的 DEGs，并确定 CPT1A 是主要贡献者，它催化长链 FA-CoA 偶联物的酰基转移到肉碱。结果表明RNF5 促进 CPT1A 表达。抑制 CPT1A表达减弱了过表达RNF5 的肿瘤促进作用。敲低CPT1A 阻断了RNF5过表达后HCC细胞中过度活跃的β-OHB 产生。总的来说，这些数据表明RNF5增加了CPT1A mRNA 表达，从而增强了脂肪性HCC中的 FA β氧化过程。
作为 E3 泛素连接酶家族的一员，RNF5 通过泛素化蛋白质的赖氨酸残基来显著影响蛋白质降解和稳定性。然而，在RNF5 过表达后观察到 CPT1A 的 mRNA 水平显著增加。虽然作者最初假设 RNF5 可能调节 CPT1A 转录，但双荧光素酶测定表明RNF5对 CPT1A 启动子的影响可以忽略不计。随后，假设 RNF5 可能影响 CPT1A mRNA 的降解。RNF5 过表达后 CPT1A mRNA 的衰变速率明显变慢，表明 CPT1A mRNA 的稳定性发生了变化。M6A 是影响各种细胞过程的最普遍的内部 mRNA 修饰。因此，作者研究了它参与 RNF5 介导的 CPT1A mRNA调节。MeRIP 测定显示 RNF5 过表达后 CPT1A 转录本的显著富集。为了进一步确认 RNF5 是否通过 m6A 修饰影响 CPT1A mRNA 的稳定性，利用 SRAMP 预测 m6A 位点，主要定位 CPT1A mRNA 的 CDS 区和 3'UTR 区。随后，作者构建了含有 CPT1A 的 CDS （称为 CPT1A-CDS） 或 3'UTR 区域 （称为 CPT1A-3UTR） 的荧光素酶报告质粒。结果表明，RNF5 主要通过 CPT1A mRNA 3'UTR 调节 mRNA 半衰期 。这一观察结果与之前的高通量 m6A 分析一致，其报道了 m6A 位点在 3'UTR 区域的主要富集。导入 m6A 修饰的位点突变体 3'UTR 区域后，RNF5 对 CPT1A mRNA 3'UTR 连接的荧光素酶的影响消失了。总体而言，这些发现表明 RNF5 调节 CPT1A mRNA 的稳定性，具体取决于其 3'UTR 区域的 m6A 修饰。为了进一步阐明 RNF5 稳定 m6A 修饰的 CPT1A mRNA 的机制，对与 RNF5 蛋白结合的相互作用物和 CPT1A mRNA 3'UTR的 m6A富集区域进行了质谱分析。总之，这些结果表明 RNF5 通过与 IGF2BP1 相互作用来增强 CPT1A 的稳定性。
RNF5 是一种公认的内质网锚定泛素连接酶，与内质网相关降解（ERAD） 有关，催化错误折叠蛋白中的泛素化以进行质量控制。接下来，作者探讨了 RNF5 是否通过IGF2BP1泛素化调节 CPT1A 表达。结果表明 RNF5过表达后IGF2BP1泛素化显著增强。泛素化测定结果表明，RNF5 促进了 K63 连接的聚泛素链添加到 IGF2BP1 中，并且IGF2BP1 K63 泛素化位点突变后泛素化丢失。进一步预测潜在的IGF2BP1泛素化修饰的赖氨酸位点 ，并从27个高置信度赖氨酸中选择7个进行验证。K190A、K450A 和 K465A 突变体阻断了 RNF5 IGF2BP1泛素化。据报道，K190 和 K450 位点的IGF2BP1泛素化增强了其致癌活性。为了进一步阐明IGF2BP1泛素化在 CPT1A mRNA 中的直接作用，使用外源转染了 HA-IGF2BP1 并进行了RIP-qPCR。RIP 测定结果显示 HA-IGF2BP1 显著富集为 CPT1A mRNA。此外，pull down和荧光素酶这些结果表明，RNF5 赋予 K63 型多泛素化到IGF2BP1上的 K190、K450 和 K465 位点，从而增强其 m6A 读取器活性。
为了确定 RNF5 在脂肪性 HCC 中的致癌作用是否通过 IGF2BP1 起作用，作者在 RNF5 过表达的 HCC 细胞中进行了IGF2BP1敲低实验，结果表明，IGF2BP1 敲低显著阻碍了 RNF5 诱导的 HCC 细胞迁移。与这些发现一致，皮下肿瘤形成测定表明，IGF2BP1敲除减弱了 RNF5 介导的皮下异种移植肿瘤生长。作者还通过RNF5 基因敲除鼠说明RNF5 敲除减轻脂肪性 HCC 的形成和进展。
总结：本研究发现RNF5是与脂肪变性HCC特异性相关的关键调节因子，与典型HCC相比，其异常上调与脂肪变性HCC的不良预后相关。RNF5在体外和体内均随着FA供应的增加而加剧了HCC的进展。脂组学和转录组学分析显示，RNF5显著提高了FA β-氧化过程中的决定酶CPT1A的mRNA水平。此外，结合RNF5和CPT1A mRNA的蛋白质谱分析表明，RNF5促进了IGF2BP1的k63型泛素化，从而提高了CPT1A m6A修饰的读取效率，并稳定了CPT1A mRNA。
本文作者：LWH
责任编辑：LQY
本文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304383524008103#sec4
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