肝纤维化是各种慢性肝病进展中的常见病理过程，最终可导致肝硬化、肝细胞癌甚至肝衰竭，严重威胁人类生命健康。目前肝移植是终末期肝病的唯一有效治疗方法，但面临诸多挑战，如风险高、成本高、供体短缺等。因此，减轻肝纤维化被认为是预防慢性肝病恶性进展的有前景的策略。然而，尽管近年来出现了小分子靶向药物，但其治疗肝纤维化的疗效仍不确定，目前尚无 FDA 批准的用于肝纤维化的生物或化学药物，迫切需要研究新的治疗靶点和候选药物。
首先，作者通过建立诱导的小鼠肝纤维化模型并给予 Sal B 处理，发现 Sal B 处理组小鼠血清 ALT 和 AST 活性显著低于CCL4组，表明其对肝细胞损伤具有保护作用。H&E 染色显示 Sal B 处理组炎症细胞浸润减少，SR 染色及 Hyp 含量测定表明胶原纤维沉积减少，且高剂量 Sal B 效果最佳，直接证明了 Sal B 对肝纤维化的抑制作用。同时，IHC、qRT - PCR、Western blotting 和 ELISA 检测均证实 Sal B 处理可显著上调肝组织中 Ecm1 的表达，而 TEM 观察到 Sal B 处理组小鼠肝细胞线粒体形态异常得到明显改善，与抑制肝细胞铁死亡的作用相符，暗示 Sal B 抗肝纤维化的机制可能与抑制肝细胞铁死亡有关，且 Ecm1 可能参与其中。
图1 Sal B减轻了CCl4诱导的肝纤维化，增加了肝Ecm1的表达
接着，在肝细胞特异性 Ecm1 敲除小鼠实验中，CCL4处理后，小鼠血清 AST 活性显著高于 WT 小鼠，且 Sal B 处理对其血清 ALT 和 AST 活性无明显改善，而 WT 小鼠中 Sal B 可显著降低这些指标，表明肝细胞中 Ecm1 缺失影响 Sal B 对肝功能的改善。H&E 和 SR 染色显示小鼠经处理后炎症损伤和胶原沉积更严重，Sal B 处理对其改善不明显，WT 小鼠则在 Sal B 处理后炎症和胶原沉积显著减轻。此外，处理后小鼠肝组织中ɑ-SMA、Col - I 表达和 TGF -β1 活性显著升高，Sal B 处理对其无显著抑制作用，WT 小鼠中这些纤维化相关因子在 Sal B 处理后显著降低，进一步证明肝细胞中 Ecm1 缺失削弱了 Sal B 对肝纤维化的治疗作用。
图2 肝细胞中Ecm1的缺失削弱了Sal B对肝纤维化的治疗作用
图3 Sal B/Ecm1的分子对接和亲和动力学测定
作者为确定 Ecm1 是否为 Sal B 的直接药理靶点，进行了分子对接模拟和亲和动力学测定。分子对接模拟结果表明 Sal B 可能与 Ecm1 的特定氨基酸残基形成氢键网络，提示二者存在结合的可能性。随后，通过 Octet Red 96 分子相互作用分析仪测定，发现 Sal B 能够直接与 ECM1 蛋白结合，其 KD 值为 6.30E - 05，这一结果直接证实了 Ecm1 是 Sal B 治疗肝纤维化的直接药理靶点，明确了 Sal B 发挥作用的分子机制。
其次，作者还构建全身 Ecm1 基因敲除小鼠模型，发现小鼠出现自发肝纤维化，H&E、Masson 和 SR 染色证实其病理变化，TEM 观察到肝细胞线粒体结构异常，表明 Ecm1 缺失可诱导肝细胞铁死亡，进而促进肝纤维化进展。Western blotting 结果显示小鼠肝组织中 xCT 蛋白表达显著低于 WT 小鼠，免疫荧光共定位和 co - IP 分析表明 Ecm1 与 xCT 在肝细胞膜上存在共定位且相互作用，说明 Ecm1 通过与 xCT 蛋白相互作用调节肝细胞铁死亡，揭示了 Ecm1 影响肝细胞铁死亡的分子机制。
图4 Ecm1与xCT相互作用，影响肝细胞铁下垂
最后，在小鼠和 WT 小鼠中研究发现，处理后小鼠肝组织中与铁死亡相关的基因（如 Ftl mRNA 降低、Acsl4 mRNA 增加）、生化指标（铁水平、4 - HNE、MDA 升高，GSH 降低）及蛋白（Tfrc 蛋白上调，Fth1、xCT 和 Gpx4 蛋白下调）表达变化显著，Sal B 处理对其影响不大，而 WT 小鼠中这些指标在 Sal B 处理后得到明显调节，表明肝细胞中 Ecm1 缺失降低了 Sal B 对肝细胞铁死亡相关指标的调节作用。在 erastin 诱导的 LO2 细胞铁死亡模型中，Sal B 和重组人 ECM1 蛋白可抑制铁死亡相关指标，但在 LO2 细胞中沉默 Ecm1 基因后，erastin 诱导的脂质过氧化损伤和铁死亡加剧，Sal B 处理效果减弱，重组人 ECM1 蛋白仍有效，充分说明 Sal B 抑制肝细胞铁死亡部分依赖于 Ecm1，进一步明确了 Ecm1 在 Sal B 抗肝细胞铁死亡过程中的重要性。
综上所述， 本文章通过一系列体内外实验发现，丹参素 B（Sal B）可显著减轻诱导的小鼠肝纤维化，其机制与上调肝细胞中细胞外基质蛋白 1（Ecm1）表达相关，且 Ecm1 缺失会削弱 Sal B 的抗肝纤维化作用；Sal B 能直接与 Ecm1 结合，Ecm1 通过与 xCT 相互作用调节肝细胞铁死亡，而 Sal B 抑制肝细胞铁死亡部分依赖于 Ecm1，从而揭示了 Sal B 抗肝纤维化的新机制，为肝纤维化的治疗提供了新的理论依据和潜在靶点。
本文作者: XX
责任编辑: TJY
全文链接：10.1016/j.redox.2024.103029
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