供稿：曾黎，武汉大学
校稿：史路菲，武汉大学
推送：史路菲，武汉大学
今天给大家分享的文章发表在Science Advances上，标题为Substrate specificity and protein stability drive the divergence of plant-specific DNA methyltransferases，通讯作者是美国圣路易斯华盛顿大学的钟雪花教授和加州大学的宋吉奎教授。
DNA甲基化是一种重要的基因表达调控机制，在许多生物学过程中发挥着至关重要的作用，比如调控基因表达、沉默转座子而维持基因组稳定性等。哺乳动物中大多数甲基化发生在CG环境中，而在植物中，这一过程则更为复杂，不仅限于CG位点，还广泛存在于CHG和CHH位点（H代表A、T或C）。植物中不同类型的DNA甲基化由不同的DNA甲基转移酶负责：MET1负责CG，CMT3负责CHG，CMT2和DRM2负责CHH。CMT3和CMT2是植物特有的同源DNA甲基化酶，但它们作用于不同的位点，其分子和进化机制一直不清楚。在本文中，作者通过对CMT2和CMT3进行全面的研究，探讨了CMT2和CMT3分化的机制，同时揭示了染色体甲基化酶分化的机制，为植物DNA甲基化功能和进化提供了重要的见解。
1 CMT2由CMT3复制和分化而来
前人的研究结果表明，玉米中的CMT3即ZMET2通过关键的氨基酸残基负责其酶对CHG底物的偏好性。利用这些关键残基作为特征，作者对植物主要类群演化过程中的代表性物种的CMT2、CMT3进行了系统发育分析。CMT3或者近缘的同源蛋白存在于所有的绿色植物中，但CMT2只存在于开花植物中（图1）。为了检验早期分歧的植物物种中的CMT3同源蛋白在开花植物中是否仍然具有相似的功能，作者异源表达了一个轮藻物种的CMT3（CbCMT3）和一个苔藓植物物种CMT3（MpCMT3），并由UBQ10启动子驱动的编码序列，并将其转化到拟南芥CMT3突变体中。接下来，作者进行了BS-seq，并发现MpCMT3几乎能完全回补拟南芥CMT3缺失的表型，其转基因表现出与野生型拟南芥相似的高水平CHG甲基化，而CbCMT3在CHG甲基化中展示出较低的活性，这表明古老物种中的CMT在功能上类似于CMT3。CMT2是CMT3的旁系同源基因，它们在蛋白质序列上高度相似。它们在DNA甲基化底物偏好性上也表现出明显的差异，CMT2在CHH底物上的甲基化活性明显高于CHG。为了进一步理解CMT2的进化过程，作者进行了类似的系统发育分析，发现基础被子植物无油樟的CMT2在相当于CMT3中R745的位置含有相同的精氨酸。以上实验表明，CMT2是通过CMT3复制和分化而来的。
2 CMT2V1200R在体外和体内诱导CHG甲基化增加
为了探究CMT2中识别CHG的精氨酸变化是否导致了CMT2失去了CHG特异性，作者基于ZMET2晶体结构生成了CMT2与hmCHG复合物的结构模型。作者将拟南芥CMT2中的相应V1200用精氨酸替换（CMT2V1200R）。作者的体外甲基转移酶实验显示，CMT2V1200R突变体在hmCHG上的活性大约是野生型CMT2的16倍，在CHG底物上的活性大约是8倍。接下来，作者进行了BS-seq实验，以研究V1200R突变对全基因组甲基化水平的影响，数据表明CMT2V1200R氨基酸位点的突变使CMT2获得了CHG甲基化功能（图1）。
图1 精氨酸残基的缺失使CMT2具有CMT3特有的底物偏好
3 CMT2含有一个对核定位很重要的长N端
尽管具有相似的蛋白质结构域，CMT2和CMT3的蛋白质长度不同，与拟南芥中的CMT3相比，CMT2具有更长的N端（图2）。同样，尽管与AmtriCMT3具有相似的域结构，但AmtriCMT2含有一个长的N端。进一步分析发现，在含有这两种蛋白质的代表性被子植物物种中，CMT2的N端比CMT3的更长，这表明这个长N端可能具有更保守的功能。接下来，作者预测了AmtriCMT2的N端结构，并发现它是无序的，CMT3和CMT2的N端也被预测含有核定位序列（NLS）。这些实验进一步证实了N端对CMT2核定位的重要性。
图2 CMT2长N端控制蛋白水平
4 CMT2的N端调控蛋白的稳定性
为了研究N端的功能，作者分别在拟南芥中异源表达构建了全长AmtriCMT2以及N端截短的AmtriCMT2的转基因。出乎意料的是，作者观察到AmtriCMT2ΔN蛋白的丰度远高于AmtriCMT2中的，但它们的转录水平十分相似。作者进一步探索AmtriCMT2的这种观察到的N端功能是否在拟南芥CMT2保守存在。作者没有进行截断，且充分考虑了NLS的必要作用，将拟南芥CMT2和CMT3的N端进行了交换。作者将CMT3和CMT2N-CMT3ΔN转化到cmt3突变体中，发现融合CMT2的N端导致CMT3蛋白水平显著降低，但是它们的转录水平相似。同样的，当长的N端被较短的CMT3的N端替换时，CMT2蛋白水平显著提高，这些结果表明，长的N端调节CMT2蛋白水平。接下来，作者直接测试CMT2蛋白的稳定性，发现CMT2N-CMT3ΔN蛋白水平迅速降低，在CHX处理4小时后减少了一半，而CMT3相对稳定，蛋白减少速率较慢。相反地的构建转基因株系，CMT2蛋白水平在CHX处理6小时后减少了一半，而CMT3N-CMT2ΔN蛋白保持稳定。仅N端本身（CMT2N-GFP）就能够以与CMT2N-CMT3ΔN相似的模式来影响蛋白稳定性（图3）。综上所述，这些数据能够表明CMT2的N端可以调节其蛋白稳定性。
图3 CMT2的N端调控蛋白稳定性
5 CMT2的自然变异表现出对环境胁迫的耐受性
作者统计了1001个拟南芥基因组中的CMT2变异，发现这些变异大多位于N端，特别是非同义突变。作者对拟南芥近亲的CMT2编码序列进行了dN/dS分析，发现N端密码子似乎在进化上是中性的。重新分析了来自1001表观基因组的48个自然品系的BS-seq数据，这些品系中存在CMT2的无义或移码突变，作者发现全局CHH甲基化水平随着CMT2突变位置和这些品系的地理位置而变化。为了证明CMT2对自然界中的CHH的DNA甲基化是重要的，作者分析了来自更多不同地理位置的拟南芥品系。通过分析，作者发现了一个自然品系Lhasa-0，其中CMT2的甲基转移酶结构域发生了突变。Lhasa-0植物的叶片结构更宽、更圆，植株矮小，分枝更多，开花时间比野生型晚。接下来，作者通过BS-seq发现Lhasa-0中全基因组的CHH甲基化水平降低，程度与CMT2突变体相似。这些数据表明CMT2导致了Lhasa-0的CHH低甲基化表型。为了确定CMT2中的突变是否导致野生品系中存在这些表型优势或劣势，作者进行了胁迫耐受性实验，数据表明CMT2可能参与植物在环境胁迫下的生存（图4）。
图4 拟南芥CMT2的自然变异
综上所述，该研究揭示了CMT2和CMT3分别维持不同DNA甲基化的机制。CMT2拥有与CMT3类似的催化机制，但由于氨基酸变异失去了对CHG的特异性。CMT2具有长的无序N末端，影响其蛋白定位和稳定性。这一研究为理解DNA甲基化酶的进化及其在环境响应中的角色提供了新的视角。研究CMT2的进化机制，也有助于更好地理解药用植物中非CG甲基化的功能和调控，以及CMT2在药用植物适应性进化中的作用，从而为药用植物品种改良和药用成分开发提供新的思路和策略。
文章编号：458
原文链接：
https://www.science.org/doi/epdf/10.1126/sciadv.adr2222
原文引用：
Jianjun Jiang#, Jia Gwee#, Jian Fang, Sarah M. Leichter, Dean Sanders, Xinrui Ji, Jikui Song* and Xuehua Zhong*. Substrate specificity and protein stability drive the divergence of plant-specific DNA methyltransferases. Sci. Adv., 2024, 10(45): eadr2222.(#为共同第一作者)
