供稿：余思宇，武汉大学
校稿：张杉，武汉大学
推送：张杉，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Redox Biology上，标题为Ferroptosis is critical for phthalates driving the blood-testis barrier dysfunction via targeting transferrin receptor，通讯作者是东北农业大学动物医学院的李金龙教授。
铁死亡是一种铁依赖性细胞死亡，不同于其他形式的细胞死亡形式。转铁蛋白受体（TfRC）是一种特异性铁死亡标志物。TfRC通过与转铁蛋白相互作用，将铁从细胞外环境导入细胞，从而有助于铁死亡所需的细胞铁库。
睾丸的发育和功能主要依赖于Sertoli细胞，Sertoli细胞的功能之一是维持血液睾丸屏障（BTB），BTB是最紧密的血液组织屏障之一，由Sertoli细胞之间的紧密连接形成。BTB在精子发生的上皮周期中经历快速重塑，紧密连接与粘附连接和间隙连接共存并协同功能。Sertoli细胞也是雄激素反应性体细胞，可以分泌转铁蛋白，雄激素受体（AR），雄激素结合蛋白（ABP）和卵泡刺激素受体（FSHR）。然而，关于DEHP对Sertoli细胞结构和功能的影响知之甚少。
图形摘要
作者进行了DEHP治疗的体内小鼠模型，发现与Vcon组相比，DEHP治疗组的睾丸指数、Johnsen评分显著降低（图1B）。DEHP治疗组的生精小管结构被破坏，松动，紊乱，生精小管之间的间隙增加，生精细胞层的数量减少。此外，DEHP处理导致广泛的线粒体空泡化和线粒体嵴丢失，以及小鼠Sertoli细胞中大量的自噬囊泡（图1C）。作者评估了DEHP对Sertoli细胞分泌功能的影响。发现与Vcon组相比，DEHP处理组AR、ABP、CSF1、GDNF、INH-α、INH-β、SCF和SOX9(都为血睾屏障相关细胞因子)水平降低，DEHP处理组CYP19、FSHR、GATA1和转铁蛋白水平升高（图1E）。在氯化镉和DEHP处理组，大量荧光信号穿过BTB并扩散到生精小管腔。DEHP治疗组精子形态异常，如头部畸形、尾巴折结等。同时，暴露于DEHP后精子畸形，TZI和SDI（畸形精子指数）也有所增加（图1J）。苯胺蓝染色后，在Con和Vcon组中，精子头部被苯胺蓝染成浅蓝色，在DEHP治疗组中被苯胺蓝染成紫色。总的来说，这些结果表明DEHP对Sertoli细胞造成功能损伤，这对精子的发育具有负面影响。
图1 DEHP 诱导支持细胞的结构和功能损伤
在DEHP治疗组中，作者团队一致观察到线粒体形态的明显改变。作者检测了谷胱甘肽和氧化应激生物标志物的水平（图2A），DEHP导致T-GSH、GSH/GSSG、GSH-PX和GST水平显著下调。非靶向代谢谱和维恩图分析表明，DEHP影响谷胱甘肽代谢系统，DEHP以浓度依赖性方式改变了代谢产物（硫脲、L-半胱氨酸、谷胱甘氨酰甲酯和氧化谷胱甘肽）的水平（图2C）。DEHP上调MDA和8-OH水平，3-NT和4-HNE的水平。作者发现DEHP降低了SLC7A11水平，并增加了TfRC（转铁蛋白）（图2D）。并且在DEHP处理组中比在Vcon组中总铁、铁离子含量更高。这些结果表明，DEHP可能通过激活Sertoli细胞中的TfRC来诱导铁死亡。
图2 DEHP 促进谷胱甘肽代谢紊乱并诱导小鼠睾丸铁死亡
通过体外实验，作者团队发现MEHP可引起TM4细胞线粒体空泡化、线粒体嵴缺失和自噬囊泡（图3C）。线粒体平均表面积和弗拉门评分提示MEHP破坏了线粒体结构。MEHP还降低了TM1细胞中AR，ABP，CSF9，GDNF，INH-α，INH-β，SCF和SOX19的水平，并增加了TM1细胞中CYP4，FSHR，GATA和转铁蛋白的水平（图3G）。作者又进行了TER（内皮细胞屏障的通透性检测）实验，MEHP引起Sertoli细胞屏障功能障碍。进一步的GSEA（基因集富集分析）表明细胞连接和细胞粘附信号通路下调，KEGG 通路分析确定了间隙连接并粘附连接途径富集。这些结果表明，MEHP诱导了TM4细胞的结构和功能损伤。
图3 MEHP 诱导 TM4 细胞的结构和功能损伤
作者引入了铁死亡激活剂（Erastin）和铁死亡抑制剂（Fer-1、DFO）。Erastin 和 MEHP 破坏了 TM4 细胞的线粒体结构，但 Fer-1 治疗缓解了这些变化。TM4细胞的KEGG分析确定了谷胱甘肽代谢途径富集（图4A）。在MEHP暴露后通过RNAseq鉴定的与谷胱甘肽代谢相关的23个差异表达的mRNA表示为簇热图。此外，与Vcon组相比，MEHP显著降低了GSH，GSH与GSSG的比率和GPH-PX活性，但Fer-1恢复了这些影响。与铁死亡相关的一个重要的Nrf2下游靶标是GPX4，因此作者团队也检测到了Nrf2蛋白的水平。结果表明，DEHP可提高小鼠睾丸组织中Nrf2和GPX4蛋白的水平。DFO能够部分缓解MEHP诱导的GPX4水平降低（图4G）。总体而言，这些结果表明MEHP诱导谷胱甘肽代谢紊乱，这是铁死亡的重要标志。
图4 MEHP 促进谷胱甘肽代谢紊乱并诱导 TM4 细胞铁死亡
作者使用荧光显微镜测定TM4细胞中的细胞内和线粒体ROS水平以及脂质过氧化强度。在Erastin(铁死亡诱导剂)和MEHP处理的TM4细胞中检测到细胞内和线粒体ROS和脂质过氧化的更显著的阳性性。MDA是作为LPO的最终产品形成的，并作为LPO强度的指标。与Vcon组相比，Erastatin和MEHP治疗组的LPO，MDA和8-OH水平也始终升高，而Fer-1减轻了这些影响。这些结果表明，MEHP加速了脂质过氧化，进而驱动了TM4细胞的铁死亡过程。
作者进行了WB，SLC7A11和GPX4水平降低，转铁蛋白和TfRC上调，并且Fer-1治疗逆转了这些变化。为了进一步验证TfRC是否调节MEHP暴露后TM4细胞中的铁水平，作者团队检测了细胞内和线粒体Fe2+并进行染色。用Erastin和MEHP处理的TM4细胞显示出FerroOrange和Mito-FerroGreen信号的强劲增加，表明细胞内和线粒体Fe迅速增加2+分别（图5 C）。然而，DFO挽救了MEHP诱导的铁死亡。此外，DFO可以在一定程度上逆转TM4细胞的细胞活力，但不能使其恢复到正常水平。这些结果表明，TfRC可能在MEHP诱导的铁死亡中起关键的调节作用。
综上所述，MEHP通过TfRC介导的铁积累和谷胱甘肽代谢紊乱诱导铁死亡，最终导致BTB功能障碍。TfRC抑制可以阻止铁死亡的发生和进展，为内分泌干扰物诱发的生殖疾病提供了一种潜在的新治疗策略。
文章编号：461
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.redox.2022.102584
原文引用：
Yi Zhao, Hao Zhang, Jia-Gen Cui, Jia-Xin Wang, Ming-Shan Chen, Hao-Ran Wang, Xue-Nan Li, Jin-Long Li*, Ferroptosis is critical for phthalates driving the blood-testis barrier dysfunction via targeting transferrin receptor, 2023, Redox Biol., 59, 102584
