供稿：郭霞，武汉大学
校稿：史路菲，武汉大学
推送：史路菲，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Nature Methods上，标题为Absolute quantitative and base-resolution sequencing reveals comprehensive landscape of pseudouridine across the human transcriptome，通讯作者为牛津大学的宋春啸教授。
假尿苷（Ψ）是细胞RNA中最丰富的修饰之一。然而，其功能仍然难以捉摸，主要是由于缺乏灵敏和准确的检测方法。本研究开发了一种称为2-溴丙酰胺辅助环化测序（BACS）的方法，能将Ψ转变为C，从而在单碱基分辨率下对Ψ进行定量分析。
Ψ和尿嘧啶之间最明显的区别是Ψ上游离的N1，它对迈克尔加成受体，如丙烯腈、丙烯酰胺和其他丙烯酸化合物具有高活性。作者设想，使用2-溴丙酰胺在Ψ的N1上加上α-卤素基团，然后使然后使O2发生后续的分子内烷基化诱导串联环化，生成氨基甲酰-1,O2-乙烯基Ψ（nce1,2Ψ），最终导致Ψ-to-C突变（图1a）。作者将这种方法命名为2-溴丙酰胺辅助环化测序（BACS）。基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI）（图1b）和超高效液相色谱联用质谱（UHPLC–MS/MS）均证实了该反应。构建的含有NNΨNN和NNUNN（N = A，C，G或U）的合成30mer RNA spike-in文库分析表过表明，Ψ的转化率为87.6%，尿苷的假阳性率为0.75%（图1c）。通过以不同比例混合NNΨNN和NNUNN分析，生成了良好的线性校准曲线，这表明该方法可以用于准确定量Ψ修饰水平（图1d）。
图1 BACS通过环化化学实现了Ψ的定量检测
为了评估BACS的性能，作者将其应用于宫颈癌细胞系HeLa和鼻咽癌细胞系C666-1的胞质rRNA（cy-rRNA）（图2a）。作者分别在HeLa 5.8S、18S和28S RNAs中检测到2，40和62个Ψ位点（图2b）。大多数位点显示出高水平的Ψ修饰（>80%），这与关于Ψ位点在人类cy-rRNA中被高度修饰的报道一致（图2c-e）。与报道的SILNAS质谱数据相比，人类cy-rRNA中已知105个Ψ位点中的103个被鉴定出来了（图2c-e）。而剩下的两个位点可以很容易地在C666-1细胞中检测到。因此，BACS可以检测到人类cy-rRNAs中所有已知的Ψ位点（图2f）。此外，本研究运用BACS方法在人剪接体snRNAs中发现了密集的Ψ位点（图2g-i）。
图2 BACS检测到人类rRNA和剪接体snRNA中已知的Ψ位点
作者应用BACS技术处理了细胞质rRNA（cy-rRNAs）和线粒体tRNA（mt-tRNAs）（图3）。作者在cy-rRNAs中发现了609个高可信度的Ψ位点。总体而言，与cy-rRNAs相比，人类mt-tRNAs的假尿嘧啶化程度较低。BACS技术比之前开发的PRAISE技术能在mt-tRNAs中检测到更多的假尿苷位点。
图3 BACS技术分析人类tRNA中Ψ修饰的全貌
作者进一步将BACS技术应用于绘制和量化HeLa mRNA中的Ψ修饰（图4）。尽管Ψ在mRNA中的修饰水平普遍较低，但BACS能够在HeLa poly-A-tailed RNA中共检测到1335个Ψ位点。该技术揭示了Ψ位点在mRNA的编码序列和3'非翻译区的富集情况，这与之前的研究结果一致。Ψ位点倾向于出现在USΨAG和GUΨCN的特定序列基序中，这些基序与已知的PUS7和TRUB1酶的识别基序相吻合。此外，作者还观察到Ψ倾向于在含有多个连续尿苷的基序中富集，如CUΨUG、ACΨUU和UUΨUU。除了Ψ图谱之外，BACS还能够以与ICE-seq类似的方式同时检测A-to-I编辑位点。携带A-to-I编辑位点的mRNA转录本与含有Ψ的mRNA转录本没有重叠，这表明A-to-I编辑和假尿嘧啶化在mRNA加工中的作用不同。
图4 HeLa mRNA中Ψ和A-to-I编辑位点的同时测序
作者通过敲除三个关键的假尿苷合成酶（PUSs）以确定它们在细胞转录组中催化的Ψ位点（图5）。与TRUB1是唯一负责cy-tRNA Ψ55的PUS酶的传统观点相反，TRUB1的敲除并没有消除人cy-tRNA中的Ψ55，这表明cy-tRNA的Ψ55位点并非唯一由该酶催化。此外，TRUB1还负责催化mt tRNA中的Ψ55位点。PUS7的敲除发现了其在cy-tRNA中的Ψ20B、Ψ36和Ψ50位点，以及mt tRNAMet中的Ψ50位点。PUS1的敲除则证实了其在细胞质cy-tRNA中修饰Ψ27/28位点的关键作用，以及在mt tRNA中修饰Ψ27/28、Ψ66、Ψ67和Ψ68位点的能力。
图5 BACS技术解析HeLa细胞中PUS酶介导的Ψ修饰图谱
最后，作者将BACS应用于5种RNA病毒，包括SARS-CoV-2、丙型肝炎病毒（HCV）、寨卡病毒（ZIKV）、丁型肝炎病毒（HDV）和辛德比斯病毒（SINV）。结果显示，没有在五种RNA病毒中检测到任何高置信度Ψ位点。这些结果表明Ψ并不直接参与这些RNA病毒的修饰。作者还分析了由DNA病毒Epstein-Barr病毒（EBV）感染的细胞系，EBV编码两种高表达的nc RNA——EBER1和EBER2。作者在EBER2中检测到一个高度修饰的Ψ114位点，而EBER1中未检测到Ψ位点。这一发现进一步证明了BACS技术在检测低丰度修饰中的高特异性和灵敏度。
图6 病毒RNA Ψ修饰的研究
综上所述，本文介绍了一种名为BACS的新技术，用于在单碱基水平上对人类转录组中的Ψ进行绝对定量分析。利用BACS，本文成功绘制了人类细胞中rRNA、snRNA、snoRNA和tRNA的Ψ修饰图谱，并扩展到mRNA，揭示了Ψ修饰在不同RNA分子中的分布特征和修饰水平。
文章编号：459
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41592-024-02439-8
原文引用：
Haiqi Xu, Linzhen Kong, Jingfei Cheng, Khatoun Al Moussawi, Xiufei Chen, Aleema Iqbal, Peter A. C. Wing, James M. Harris, Senko Tsukuda, Azman Embarc-Buh, Guifeng Wei, Alfredo Castello, Skirmantas Kriaucionis, Jane A. McKeating, Xin Lu and Chun-Xiao Song*. Absolute quantitative and base-resolution sequencing reveals comprehensive landscape of pseudouridine across the human transcriptome. Nat Methods, 2024, 21:2024–2033.
