供稿：刘玮，武汉大学
校稿：曾黎，武汉大学
推送：曾黎，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Nature Communications上，标题为SAM-DNMT3A, a strategy for induction of genome-wide DNA methylation, identifies DNA methylation as a vulnerability in ER-positive breast cancers，澳大利亚墨尔本蒙纳士大学的Joseph Rosenbluh教授和Melissa C. Southey教授是本文的共同通讯作者。
DNA甲基化是一种表观遗传标记，在调控基因表达中起着关键作用。异常的DNA甲基化模式与多种疾病有关，包括癌症、神经系统疾病和发育障碍。DNA甲基化的孟德尔式遗传已在各种生物体中得到证实，可遗传的DNA甲基化与不同类型癌症的易感性有关。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNMTs）诱导的，CRISPR技术提供了在基因组所需位点精确诱导DNA甲基化的潜力。有研究者利用dCas9与DNMT3A融合，开发了一个可编程的位点特异性DNA甲基化平台，但是该系统诱导了低水平的DNA甲基化，容易产生脱靶效应。SunTag系统可以更具体地诱导DNA甲基化，而脱靶效应不那么普遍。DNA甲基化研究的一个主要空白是目前缺乏诱导全基因组DNA甲基化的策略。在本文中，作者展现了一种可以诱导全局DNA甲基化的有效工具。
作者发现了协同激活介质（SAM）系统作为诱导DNA甲基化的方法（图1A）。该策略能够将三个DNMTs招募到所需的位点（图1B）。通过分析高分辨率熔解曲线（HRM）来测量DNA甲基化。为了测试这种方法诱导位点特异性DNA甲基化的能力，作者设计了两个靶向BRCA1启动子上CpG序列的sgRNAs（图1C）。用非靶向对照（sgGFP）或两个BRCA1靶向sgRNAs（融合DNMT3A，DNMT3B或DNMT1的SMA系统）、含有BRCA1靶向sgRNAs的SunTag-DNMT3A系统转染HEK293T细胞，在用指定的DNMT转染3天后，作者使用BRCA1特异性引物的HRM分析，分析了BRCA1位点的DNA甲基化（图1D-F）。结果发现，与未转染的细胞相比，sgGFP也显示出DNA甲基化的增加；三种SAM-DNMT系统在BRCA1位点靶向诱导的甲基化水平相似；同SunTag系统相比，SAM系统诱导了更高水平的DNA甲基化。作者选择了SAM-DNMT3A进行进一步的实验。
图1 SAM-DNMT系统在所需位点诱导高水平的DNA甲基化
汇集的遗传筛选可用于高通量研究遗传扰动及其对生物过程的调节。作者设计了以前1000个可遗传甲基化标记为目标的汇集sgRNA文库，以识别人类基因组中甲基化诱导增殖表型的位点。为避免SAM-DNMT3A可能的抑制转录效应（CRISPRi），作者使用催化不活跃的DNMT3A（SAM-DNMT3A-inactive）作为对照，通过HRM检测证实激活的DNMT3A是诱导DNA甲基化所必需的。sgRNA文库包括10286个sgRNA，靶向人类基因组中的1009个基因组区域。用表达SAM-DNMT3A或SAM-DNMT3A-inactive的MCF7、T47D或BRE80-T5细胞进行筛选。MCF7和T47D是两种雌激素受体（ER）阳性的乳腺癌细胞系，BRE80-T5是一种正常的永生化ER阴性乳腺上皮细胞系。比较SAM-DNMT3A和SAM-DNMT3A-inactive细胞中的sgRNA丰度，未发现显著差异（图2B-D）。作者使用MAGeCK算法，计算了这些区域的基因评分，也没有发现DNMT3A活跃或不活跃的细胞之间有显著差异（图2E-G）。这些结果表明，这些甲基化区域可能都没有功能影响，或者SAM-DNMT3A诱导的位点特异性DNA甲基化是非特异性的。
图2 SAM-DNMT3A合集筛选未发现任何与增殖相关的hits
使用EPIC v1.0甲基化阵列测量SAM-DNMT3A系统的特异性（图3A）。量化表达SAM-DNMT3A或SAM-DNMT3A-inactive的BRE80-T5或T47D细胞的DNA甲基化水平，结果发现，与没有表达sgRNA的细胞相比，表达指向基因组任何区域的靶向sgRNA的细胞对整个基因组的DNA甲基化诱导有很强的影响（图3B）。可以在整个基因组中观察到DNA甲基化的增加，并不局限于特定的染色体或区域（图3C，D）。SAM-DNMT3A在整个基因组中诱导了高水平的全局DNA甲基化（图3F，G）。作者在另外两个细胞系（MCF7和BT549）中重复了这个实验，细胞分别用SAM-DNMT3A或SAM-DNMT3A-inactive（含或不含AAVS1靶向sgRNA）进行三次转导，并使用EPIC v1.0阵列测量全局DNA甲基化。多维尺度分析显示，在两种细胞系中，复制聚集在一起，表达SAM-DNMT3A的细胞聚集在远离无sgRNA表达细胞或表达SAM-DNMT3A-inactive细胞的地方（图3E）。这些结果表明，SAM-DNMT3A诱导的DNA甲基化不是作用于特定的基因组区域，而是随机沉积在整个基因组中。为证实SAM-DNMT3A诱导的全局甲基化是由DNMT3A酶活性介导，作者使用DNMT抑制剂地西他滨处理表达SAM-DNMT3A或SAM-DNMT3A-inactive（靶向AAVS1的sgRNA）的MCF7细胞。LINE-1是一个逆转录转座子序列，在人类基因组中估计有50万个拷贝。为了测量整体DNA甲基化，作者使用了LINE-1探针的HRM分析。结果发现，SAM-DNMT3A与AAVS1靶向sgRNA诱导LINE-1甲基化增加，而这种甲基化被地西他滨抑制（图3H）。这些结果表明，在sgRNA存在的情况下，SAM-DNMT3A系统诱导非特异性全局基因组DNA甲基化，这与sgRNA的特征或使用的细胞系无关。
图3 SAM-DNMT3A诱导全局非特异性DNA甲基化
为了测量SAM-DNMT3A的动态，作者将HaloTag结构域融合到dCas9-DNMT3A的C端。转染HeLa细胞后用单粒子跟踪测量动力学。结果发现，HaloTag-dCas9-DNMT3A在sgRNA存在下迁移性显著降低（图4A）。在sgRNA存在的情况下，HaloTag-dCas9-DNMT3A结合在整个染色体上（图4A，B），这表明dCas9-DNMT3A-sgRNA复合物在DNA中搜索目标序列，dCas9-DNMT3A在扫描基因组寻找与间隔序列匹配的序列时，在sgRNA存在的情况下诱导全局DNA甲基化。
图4 SAM-DNMT3A在sgRNA存在的情况扫描基因组
在上述实验中，作者发现表达SAM-DNMT3A系统的ER阳性乳腺癌细胞系难以长时间培养，推测诱导全局DNA甲基化是ER阳性乳腺癌的一个脆弱因素。为了验证这一假设，作者测量了ER阳性和ER阴性乳腺癌细胞系的整体DNA甲基化水平。作者使用针对LINE-1序列的探针进行HRM检测，结果表示，与ER阴性乳腺癌细胞系相比，ER阳性乳腺癌细胞系的DNA甲基化基础水平较低（图5A），这与先前使用TCGA数据集的报告一致。为了直接测量诱导DNA甲基化对ER阳性乳腺癌细胞增殖的影响，作者使用了一组7个乳腺癌细胞系（4个ER阳性和3个ER阴性），表达SAM-DNMT3A或SAM-DNMT3A-inactive，没有sgRNA或两个AAVS1靶向sgRNA诱导全局DNA甲基化（图5B，C）。结果发现，诱导全基因组DNA甲基化对ER阴性乳腺癌的增殖没有影响，而在ER阳性乳腺癌细胞系中，DNA甲基化诱导显著抑制细胞增殖（图5D）。为了验证在ER阳性乳腺癌细胞中观察到的增殖减少是由DNA甲基化的全局诱导引起的，作者拯救实验，用地西他滨处理表达SAM-DNMT3A或SAM-DNMT3A-inactive且AAVS1靶向sgRNA的MCF7细胞（ER阳性）（图5E）。结果显示，低浓度的地西他滨挽救了表达SAM-DNMT3A的MCF7细胞的生长（高浓度的地西他滨在所有条件下都是有毒的），这表明，SAM-DNMT3A以细胞系独立的方式诱导全局DNA甲基化，并且诱导DNA甲基化是ER阳性乳腺癌的脆弱因素。
图5 诱导DNA甲基化是雌激素受体阳性乳腺癌的一个脆弱因素
综上所述，作者发现SAM-DNMT3A是一种简单、稳健且有效地诱导全基因组DNA甲基化的策略。SAM-DNMT3A为研究DNA甲基化如何与正常或疾病条件下的表型相关提供了一种重要工具。
文章编号：468
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-54824-8
原文引用：
Mahnaz Hosseinpour, Xinqi Xi, Ling Liu, Luis Malaver-Ortega, Laura Perlaza-Jimenez, Jihoon E. Joo, Harrison M. York, Jonathan Beesley, C. Elizabeth Caldon, Pierre-Antoine Dugué, James G. Dowty, Senthil Arumugam, Melissa C. Southey*, Joseph Rosenbluh*. SAM-DNMT3A, a strategy for induction of genome-wide DNA methylation, identifies DNA methylation as a vulnerability in ER-positive breast cancers.Nat. Commun., 2024, 15, 10449.
