文献解读：交替高脂饮食通过中性粒细胞重编程促进动脉粥样硬化-2024-Nature

文摘 2024-11-25 22:00 江西

题目：Alternating high-fat diet enhances atherosclerosis by neutrophil reprogramming

通讯作者：Hafid Ait-Oufella

单位：巴黎西岱大学巴黎心血管研究中心

文献来源：2024_Nature

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-024-07693-6

研究背景

在未来15年内，动脉粥样硬化相关心血管疾病将成为全球死亡事件的主要原因之一，所以我们需要针对其开发新的预测、预防和治疗策略。动脉粥样硬化是一种大动脉和中型动脉的慢性炎症疾病，由于内皮下的载脂蛋白的修饰导致其发展。内皮细胞的炎症反应与循环白细胞不同亚群向血管壁的募集高度相关。尤其是其中的单核细胞对内膜巨噬细胞库有相当大的贡献，实验已经证明巨噬细胞的分化、激活和增殖能够促进硬化斑块的增长。

最近的研究表明，循环白细胞群中的中性粒细胞也对动脉粥样硬化的发生有贡献，参与早期及患者的斑块破裂过程。当前对动脉粥样硬化机制的理解主要集中在长期的高脂饮食模型，是一种慢性的高胆固醇血症。这与人类的饮食情况有着相当大的区别，人们常常根据自己的体重及其他因素调节饮食习惯，这会导致血脂及胆固醇水平的动态变化。此外，服用他汀类药物的人群，在停药后也会导致血脂和胆固醇水平的波动，因此对于高脂饮食(HFD)和高胆固醇血症的交替变化对动脉粥样硬化的影响暂时还不清楚。

近期研究还表明，当骨髓细胞暴露在危险相关的分子模式（包括氧化脂质等物质）中，会导致其适应持久的非特异性促炎表型（又称训练后免疫），复杂的免疫重编程会在再次刺激后产生更剧烈的反应，尤其是细胞因子的分泌，因此理解交替暴露机制变得更加重要。

逻辑结构

1.交替高脂饮食和动脉粥样硬化间的关系

作者首先给6周龄动脉粥样硬化模型小鼠(Ldlr, Apoe)分别喂食不同的饮食方案，持续高脂组(Conti.)是先喂食8周CD，再喂食8周HFD，交替高脂组(Alt.)是先喂食4周HFD随后改为8周CD，最后再喂食4周HFD，保证整体高脂暴露时间相同。随后检测斑块大小发现，在胆固醇水平无差异的条件下，交替组小鼠的斑块明显增大，而且巨噬细胞在斑块中的含量也明显增加，坏死核面积显著增大。于是作者通过表型得出交替HFD诱导了更加严重的斑块表型的结论，二者高度相关。

2.交替高脂饮食对动脉粥样硬化的促进是否是肠道微生物组成发生改变引起的？如果不是肠道微生物，是否是免疫反应介导的？

①肠道微生物

由于改变的是饮食方案，加之先前有研究表明肠道微生物是动脉粥样硬化的关键驱动因素，于是作者首先推测可能在两组小鼠当中，肠道微生物的组成发生了变化。在14周龄（交替组暴露4周HFD，随后4周CD VS 持续组8周CD）通过16S RNA-seq发现，变化与前人研究相同。进一步在小鼠的食物中添加抗生素清除肠道微生物，整个饮食方案喂养结束后对小鼠的斑块大小进行检测，发现交替组仍然具有更大的斑块表型，说明肠道微生物在交替HFD过促进的动脉粥样硬化表型不产生作用。

②免疫反应

既然不是肠道微生物，鉴于第一部分观察到巨噬细胞的增加，所以作者对两组小鼠的脾脏进行检测。其中交替组小鼠脾脏IL-6和Tnf的mRNA表达水平较高，离体刺激结果结果也相似。通过流式对血和脾脏中的白细胞群进行分析，发现髓系群体没有差异，但是血中B细胞的数量在交替组中有略微升高。脾细胞的数量没差异，但是其中B/T细胞的含量变得更高，而且斑块中浸润的CD3+ T细胞数量更多了。

观察到此，作者怀疑有可能是B/T细胞介导了交替高脂饮食对动脉粥样硬化的加速，所以下一步通过遗传学手段敲除Rag2（无法产生成熟的B/T细胞）和脾切除方法，再次使用相同的方案对其进行喂养，发现并没有改变交替组中恶化的斑块表型，所以B/T细胞的适应性免疫应该不是原因。

3.机制究竟是什么？

在两条路都没走通后，作者运用RNA-seq分析了第13周（高脂饮食重新暴露一周后）两组小鼠的动脉（此时小鼠的斑块大小还是相似的），发现整体的转录调控发生了很大的变化，髓系细胞稳态在通路中被富集到，基于此，作者开展实验探究是否是交替的HFD导致了髓系细胞的变化。

作者发现血中的单核细胞与胆固醇的变化趋势相同，病变区域的巨噬细胞的数量也相似，路似乎又走不通了。所以作者又开展动脉免疫细胞的scRNA-seq对白细胞分群，再次对单核细胞和巨噬细胞进行分群后发现仍然没有变化，至此作者真切地排除了巨噬细胞的变化。

不是巨噬细胞，又能是什么？作者将转录组和单细胞转录组分析结果结合来看，发现髓系和氧化应激通路显著上调，而且在再暴露条件下中性粒细胞出现了第二类群，于是将目光转投中性粒细胞。结合HFD暴露情况，发现再暴露后血中中性粒细胞的数量上调超过第一次的五倍，包括CD62L+（血中未成熟的中性粒细胞），而且血中招募中性粒细胞的趋化因子的含量也在交替高脂条件下显著提升，第二类群还表现出更强的促炎表型（表现在Il1a，Il1b，Nlrp3和Tnf表达的上调）。

通过对斑块中的中性粒细胞细胞外陷阱（NET）进行检测，发现NET含量在交替组显著提高。为直接探究中性粒细胞的作用，作者使用Ly6G抗体耗竭体内的中性粒细胞，交替组小鼠的表型得到逆转，斑块增大效应消除。该部分作者锁定了中性粒细胞的重要作用，在交替高脂饮食的背景下，中性粒细胞的成熟和运输发生显著变化。

4.基于“训练后免疫”的研究，粒细胞/巨噬细胞祖细胞（GMP）在交替高脂饮食过程中发挥了作用吗？

先前的研究表明，生命早期过程中暴露于西方饮食会诱导骨髓细胞中的GMP的功能变化和表观修饰。在这部分作者主要想确认训练后免疫对交替高脂饮食导致的动脉粥样硬化加速表型的贡献。于是作者首先设计早期高脂饮食暴露和非暴露小鼠，检测发现18周龄时早期暴露的小鼠骨髓中的GMP和中性粒细胞都显著高于未暴露组，并且白细胞介素等细胞因子的表达水平显著上调。

通过对这些小鼠的骨髓进行scRNA-seq，发现HFD的暴露会导致长期的中性粒细胞祖细胞的变化，而且基因水平也发生了显著的表达差异（包括重要的转录因子Runx1）。随后骨髓移植实验表明（骨髓移植小鼠喂养8周HFD模拟再暴露），再暴露小鼠的骨髓移植导致了更严重的斑块表型，IL-6的表达也显著提高，因此这些实验表明HFD会导致长期的骨髓细胞的重编程。

在证实骨髓细胞的变化后，作者运用最初设计的饮食方案，探究该过程中髓系祖细胞究竟发生了什么变化。同样在第13周后检测，发现GMP类群在交替组骨髓中显著减少，未成熟的中性粒细胞增加，相反的趋势表明交替高脂条件下髓系祖细胞分化和成熟的重塑。对细胞因子进行检测发现，未成熟中性粒细胞中的IL-1β分泌明显提高，且骨髓中IL-1β和IL-6的分泌同样显著增加。

目前看到的都是表型，作者接下来想探究上游机制，由于交替高脂饮食方案导致血脂水平的变化，作者猜测上游信号可能是脂质分子与其受体结合所诱导的，进而导致了快速的骨髓生成效应。作者使用了3种遗传模型小鼠，分别是Cd36-/-、Myd88-/-和Tlr4-/-，用同样的方案喂食小鼠，首先验证中性粒细胞急性生成的表型，发现CD36敲除小鼠并没有影响，而Myd88和Tlr4敲除小鼠中的表型消失，IL-1β水平也是如此。这些实验证明了TLR4参与骨髓细胞紧急生成及IL-1β产生的关键作用。

作者又回头验证先前发现的RUNX1在GMP中下调的表型，发现中性粒细胞的变化趋势与RUNX1的变化趋势相反。因此作者合理外推，如果在骨髓细胞中特异性敲除RUNX1，是不是就能加剧中性粒细胞的急性产生？果然，敲除实验证实了作者的猜想，不仅中性粒细胞数量大量增加，而且IL-1β产生极其显著上调，并且进一步通过流式证实了其来源主要是新产生的中性粒细胞。

5. 阻断IL-1β通路的功能是否能改善交替高脂饮食带来的加速效应？

作者移除了模型小鼠的骨髓，并移植IL-1β敲除鼠的骨髓，发现交替高脂饮食诱导的急性中性粒细胞增加被消除，动脉粥样硬化加速同样消失。同样的思路，移植IL-1R小鼠的骨髓，表型相同。使用IL-1β抗体处理结果也相同。最后作者在药理学上运用MCC950（炎症小体抑制剂）处理小鼠，交替组小鼠得到了治疗。

研究结论

1.交替HFD通过IL-1β依赖性中性粒细胞祖细胞增殖谱改变加速动脉粥样硬化；

2.交替HFD的促动脉粥样硬化作用可以通过抗IL-1β中和抗体或炎性小体抑制剂逆转。

创新点与不足

创新点：

在更符合人类饮食习惯的背景下对动脉粥样硬化的发病机制进行探究，并强调了早期暴露对骨髓细胞长期的重编程效应，同时找到了能有效抑制动脉粥样硬化的通路和旧药新用的思路。

不足：

机制研究不够深入。

http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=Mzk0MjQ1OTk5NQ==&mid=2247488394&idx=3&sn=bef82033612dd4ce7f95a5839a072eea

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