文献解读| 肿瘤免疫治疗与巨噬细胞M1极化

文摘   2024-11-25 22:00   江西  
今天分享的文章于2024年5月online在Cancer Cell (Q1/1区, IF 50.3),题目为“Immunotherapy-activated T cells recruit and skew late-stage activated M1-like macrophages that are critical for therapeutic efficacy”,讲的是肿瘤免疫治疗中CD8+T细胞于巨噬细胞M1极化的故事,图形摘要如下:
Background
CD8+T细胞固然重要,其他免疫细胞功能不可忽视。调动机体本身的免疫系统以抵抗肿瘤已经在多种癌症中取得成功。目前的免疫治疗主要依靠激活T细胞,包括癌症疫苗,免疫检查点(ICIs),CD3双特异性抗体。越来越多的证据表明,仅依赖肿瘤免疫微环境(TME)中的T细胞是不够的,TME中的其他免疫细胞同样与患者的生存密切相关,但目前的研究不够深入
髓系细胞在基于T细胞的免疫治疗中会促进肿瘤消退。髓系细胞通常被认为发挥免疫抑制功能,但越来越多研究报道了其抗肿瘤的角色。目前认为髓系细胞主要通过CXCL9/10-CXCR3轴招募T细胞,也有可能涉及其他通路。髓系细胞在基于T细胞的疗法中对肿瘤消退的贡献尚不清楚    
Results
1 对免疫治疗的反应取决于CD8+T细胞和巨噬细胞
干实验:KM曲线,bulk转录组评估免疫浸润水平
湿实验:体内实验(治疗干预,原位成瘤),流式细胞术
两种基于癌症疫苗的体内实验表明responder的TME表现为免疫炎性
第一种方案
A 原位成瘤(白血病)与疫苗protocol,B 疫苗组肿瘤显著小于非治疗组(注意这里不是生存分析,钟点事件是肿瘤体积>1000 mm3),C bulk转录组表明responder中各种免疫细胞的得分增加,D 流式证实了bulk发现    
第二种方案
E 原位成瘤(黑色素瘤)与疫苗联合双抗protocol,F 治疗组肿瘤显著小于非治疗组,
G-H 治疗组的免疫细胞浸润水平同样更高       

 

    
Figure 2.巨噬细胞对免疫治疗疗效是必需的,尤其是M1
干实验:KM曲线;湿实验:注射敲低抗体来调控特定免疫细胞数量(CD8对应CD8+T细胞,NK1.1对应NK细胞,CD115对应巨噬细胞,Ly6G对应中性粒细胞),质谱流式
敲除NK细胞不影响免疫治疗疗效,而CD8+T确实必不可少
A-B 免疫治疗与调控免疫细胞protocol,C-D KM曲线说明在两种治疗中,敲低NK细胞对肿瘤影响不大,敲低CD8+T细胞显著增加肿瘤体积,E 流式证明调控效率
 敲低巨噬细胞在两个治疗体系中都降低了疗效
G-H 敲除巨噬细胞和中性粒细胞都会降低疗效,但巨噬细胞更显著,I 质谱流式看敲除效率(补充材料对其他细胞类型的数量也进行了表征,以此确定敲除某类细胞对疗效的影响只取决于干预的细胞),看完总数看亚型,被敲低的巨噬细胞主要是M1       

 

    
Figure 3. M1的存在依赖于瘤内激活的CD8+T细胞
干实验:单细胞转录组分群注释;湿实验:流式细胞术
作者将疫苗vs疫苗+CD8+T细胞敲低的小鼠肿瘤送了单细胞转录组测序,进一步证实了前一部分流式所得
A 免疫细胞亚群细分,B –C CD8+T细胞敲低处理后亚群17显著增加,11和19显著减少,D 热图进一步具象化了两组差异,尤其是RMC11+RMC19(INOS上调作为标志的M1)和RMC17(EGR2和SIRPα上调作为标志的M2),F 流式与单细胞发现相互印证,G-H 作者平行对B16F10做了同样的分析,同样支持CD8+T细胞敲低后M1的下调与M2的上调!
Figure 4. T细胞能够增强巨噬细胞向M1的极化
湿实验:体外模拟巨噬细胞在体内受到的各种刺激,流式细胞术,qPCR
在基本确定CD8+T细胞能够促进M0极化为M1的基础上,作者进一步设计了体外实验探究CD8+T细胞与巨噬细胞的交互
A 实验设计 从小鼠骨髓提取未受任何刺激的M0和LPS+IFNG刺激所致极化的M1,从小鼠脾脏提取激活的T细胞上清,B-C 流式证实CD8+T细胞的刺激能够增加巨噬细胞浸润水平,LPS,脾脏提取的T细胞上清,免疫治疗后肿瘤裂解液的T细胞上清都可以,且上调程度不同,D 基于单细胞转录组的轨迹分析说明INOS在M1极化的晚期被激活
E 基于qPCR,脾脏提取的T细胞上清和肿瘤裂解液均可上调M1(与上图相同为体外条件刺激),且两者联合更显著,    F 上述不同条件上调M1 marker的程度不同,因此联想到TME条件中是否有T细胞外的其他途径能够促进M1极化。基于文献检索,作者设计了TLR信号和IFNG信号的阻断,证明TME中的TLR7/9信号和IFNG信号对M1的激活必不可少,G 用活化的 T 细胞上清液和/或肿瘤裂解液培养未刺激的巨噬细胞,结果显示两者都能增加对肿瘤细胞的吞噬作用
Figure 5. 巨噬细胞的晚期激活依赖CCR5介导的与CD8+T细胞共定位
干实验:bulk转录组差异分析;湿实验:流式,免疫荧光
Bulk转录组进一步探索T细胞激活巨噬细胞的机制
A 两组动物实验/两种免疫治疗的肿瘤送bulk转录组测序,发现治疗后CCL3/4/5以及IFNG表达一致升高,这些都已知能够激活巨噬细胞,B 用CD3/CD28平行刺激脾脏分离的T细胞以及免疫治疗后的B16肿瘤上清中的T细胞,流式证实了转录组的发现
多重免疫荧光证实T细胞与巨噬细胞的同生同死
C-D 免疫治疗后CCR5阻断vs不阻断分组下,观察CD8+T细胞与巨噬细胞的共定位。青色为CD8,紫色为F4/80(巨噬细胞),橙色为iNOS(M1),发现CCR5信号阻断后显著减少了CD8+T细胞和巨噬细胞/M1的浸润水平及共定位!    E-F 对免疫荧光的定量
Figure 6. 晚期激活的M1可以剥夺肿瘤细胞的L精氨酸
干实验:KM曲线,bulk转录组差异分析;湿实验:基因敲除小鼠,肿瘤细胞与巨噬细胞共培养,NO检测
确定iNOS+M1的重要角色后,作者转而构建了iNOS敲除小鼠
A-B 在RMA荷瘤模型中,iNOS敲除后,免疫治疗完全不起效!B iNOS敲除在B16荷瘤模型中对疗效影响不大
排除iNOS敲除对TME中其他因素的影响    
D iNOS敲除对CD8+T细胞和巨噬细胞浸润水平无影响,E-F iNOS敲除对T细胞和巨噬细胞的功能效应无影响(主要看前两列对比)
M1确实释放更多的NO,但这不是iNOS介导的肿瘤杀伤的主要机制
G:既往文献报道iNOS功能:将 L-精氨酸转化为 L-瓜氨酸并释放NO,进而杀死肿瘤细胞(Mechanisms of macrophage-mediated tumor cell killing: A comparative analysis of the roles of reactive nitrogen intermediates and tumor necrosis factor.Int. J. Cancer. 1990; 46: 682-686)。通过Griess反应测定对NO定量证实了M1释放NO增加
补充图8E-H:肿瘤细胞与WT和iNOS敲除小鼠的BMDMs共培养(M0/M1)看对肿瘤的杀伤以及巨噬细胞的吞噬能力,阴性结果说明NO释放增加这条途径不是iNOS诱导肿瘤消退的主要机制  

 

    
G:既然杀伤肿瘤的关键不在NO,那会否在作为肿瘤必须营养物质L-精氨酸呢?在不同浓度的 L- 精氨酸存在下培养RMA和 B16 肿瘤细胞,RMA肿瘤存活率与培养基中L氨基酸水平的强相关证明了这一假设。即 iNOS 介导的关键营养物质 L-精氨酸的转化是晚期活化M1的主要抗肿瘤机制!
Figure 7. 晚期激活的M1在人和鼠中均与免疫治疗反应相关
干实验:单细胞转录组分亚群,拟时序分析,差异分析,基因集打分,免疫治疗bulk队列差异分析;湿实验:抗PDL1治疗小鼠
这部分用到的单细胞转录组数据实际上是图3用到的数据的子集,作者提取了RMA荷瘤小鼠中的responder样本,对其中巨噬细胞(CD11b+F4/80+)进行了进一步的亚群细分
A-C:分群明细及相应marker(以生物学功能命名),D:拟时序分析证明cluster3处于分化最末,其marker也正包含Nos2 (也就是人的iNOS),再次证明了iNOS+M1的存在以及其“晚期激活”,E:Cluster 3 marker基因的通路富集    
由于以 C3 为代表的晚期活化的 M1 样巨噬细胞与 ICI 反应性相关巨噬细胞群 M3 高度相似,作者进一步关注了RMA荷瘤小鼠对抗PDL1治疗的敏感性:
G:单药治疗效果差,但联合能够激活M3的肿瘤疫苗能够显著提高疗效!H:基于黑色素瘤免疫治疗bulk RNAseq队列及其免疫治疗反应信息,发现responder的患者C3基因集得分更高!

有文献报道在 CT26 结肠癌肿瘤模型中,促炎巨噬细胞群(称为 M3)的存在与对检查点抑制剂的反应相关(Baseline Frequency of Inflammatory Cxcl9-Expressing Tumor-Associated Macrophages Predicts Response to Avelumab Treatment.Cell Rep. 2020; 32107873),他们也将巨噬细胞分为9群,作者将自己的各群TOP50marker与该数据进行了比较
图F(左):两个数据的C3的TOP50 marker重合率竟达到72%!
图A-D(右):上述文献的巨噬细胞分群
Figure 8.多种肿瘤中存在高度相似的同种巨噬细胞群,且与免疫检查点抑制剂治疗反应相关
干实验:泛组织巨噬细胞单细胞图谱和乳腺癌免疫治疗单细胞数据集分析
Mulder等人基于各种健康/疾病的单细胞数据构建了巨噬细胞图谱(Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease.Immunity. 2021; 54: 1883-1900.e5)
A Mulder图谱中主要的巨噬细胞亚群,B-C 本研究诞生的C3 signature(图7)得分映射到Mulder图谱,发现Multer 6亚群很有可能是晚期激活的M1,D Mulder 6亚群几乎只出现在Mulder图谱的癌症组织中,E Mulder 6亚群marker基因的通路富集,与M3基本一致    
Bassez等人对接受抗PD1治疗前后的乳腺癌样本进行了单细胞转录组测序,并给出了治疗反应信息(A single-cell map of intratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer.Nat. Med. 2021; 27: 820-832)
F:乳腺癌TME中的巨噬细胞亚群,G:治疗反应信息映射,H-L:Mulder 6和本研究的C3得分映射到乳腺癌巨噬细胞tSNE中,Bassez 0亚群可能是乳腺癌TME中晚期激活的M1,M:在Bassez数据集中,T细胞克隆扩增(expansion)被认为是responder的标志,而Bassez 0在responder治疗前和治疗后的比例均显著更高
总结
这项研究以免疫治疗荷瘤小鼠为背景,流式和bulk转录组发现治疗后/responder中免疫细胞浸润水平普遍更高,随后使用抗体敲除各类主要细胞后发现CD8+T细胞和巨噬细胞的M1亚型对疗效必需,且M1的水平可能受CD8+T细胞水平的影响。接下来作者对CD8+T细胞敲除与否的TME进行了单细胞转录组测序,证实了CD8+T细胞能够激活M1,且其标志iNOS在晚期被激活。进一步,作者构建了iNOS稳定敲除小鼠,发现iNOS敲除后疗效显著下降,并提出能够上调M1的疫苗联合抗PDL1组合,实现了“1+1>2”的疗效,并证明iNOS介导的抗肿瘤机制可能是TME中L-精氨酸剥夺。机制的研究到这里就结束了,作者转而靠向临床意义,对responder小鼠的巨噬细胞进一步细分,找出iNOS阳性亚群并据此构建了M3 signature,通过联合已发标的Mulder巨噬细胞图谱以及免疫治疗下乳腺癌TME中的巨噬细胞数据集,说明M3 signature能够预测免疫治疗反应。   
这项研究没有涉及深入的机制探索,但测序思维贯穿始终,自己的样本送了bulk转录组,单细胞转录组,联合已发表的巨噬细胞图谱的同时,纳入乳腺癌免疫治疗数据集,从基础到临床将iNOS+M1巨噬细胞的抗肿瘤免疫效应讲的淋漓尽致,对干湿结合的思维很有帮助,做的很棒!
         

 

   

V言微语
从微生物与健康视角,以小见大,推荐并探讨微生物科技前沿与行业动态。
 最新文章