工程化丁酸梭菌-pMTL007-GLP-1通过促进线粒体自噬对帕金森病小鼠模型的神经保护作用Neuroprotective effect of engineered Clostridium butyricum-pMTL007-GLP-1 on Parkinson's disease mice models via promoting mitophagy
Q1 二区 IF：10.684
背景
帕金森病（PD）是第二常见的神经退行性疾病，患病率正在迅速上升。PD患者患有进行性运动功能障碍和认知障碍。越来越多的研究支持线粒体功能障碍与PD在遗传和病理上有关。发现散发性PD患者中枢神经系统线粒体在死后脑中发生形态学改变和功能丧失。此外，PD中的线粒体损伤可导致多巴胺能神经元的进一步凋亡。线粒体命运的调节因子是线粒体自噬，它通过溶酶体介导的降解清除受损的线粒体。线粒体损伤和有缺陷的线粒体自噬已在体内和离体PD模型中发现。已证明几种PD相关蛋白在线粒体自噬的调节中发挥作用，如PTEN诱导的激酶1（PINK 1）和Parkin RBR E3泛素蛋白连接酶（Parkin）。先前的工作已经发现，PINK 1/Parkin通路是经典的线粒体自噬通路，其中PINK 1能够在受损的线粒体上积累，从而诱导线粒体自噬。8 PINK 1和Parkin中的突变阻止受损线粒体的消除，从而触发PD的发展。
越来越多的研究证实肠道微生物群与PD有关，研究发现PD患者存在肠道生态失调。丁酸梭菌（C. butyricum）是一种益生菌菌株，可以在消化道中存活，并具有多种治疗益处。丁酸菌通过肠道微生物群-胰高血糖素样肽-1（GLP-1）途径改善了PD小鼠的运动缺陷，提示丁酸衣原体可能会缓解PD的症状。GLP-1是一种由回肠内分泌细胞分泌的肠促胰岛素激素。先前的工作表明，GLP-1可以通过调节神经元细胞产生和神经凋亡对中枢神经系统提供保护性影响。 然而，二肽基肽酶-IV（DPP-IV，CD26）可以快速水解功能性GLP-1，导致GLP-1的半衰期不到2分钟。GLP-1受体（GLP-1R）激动剂在临床试验中获得了极大的效果。利拉鲁肽具有97%的同源性和13小时的半衰期，是第一个源自天然GLP-1的GLP-1R激动剂。值得注意的是，利拉鲁肽穿过血脑屏障并进入中枢神经系统。而市售GLP-1类似物需要连续注射，导致依从性差。因此，本研究旨在将GLP-1编码基因序列整合到C.丁酸杆菌构建工程菌株，以构建一种工程菌株，该菌株可以将GLP-1的神经保护功效与丁芥的益生菌特性相结合。
结果
1.丁酸梭菌-GLP-1体外微生物特性
(图1a) ELISA分析丁酸梭菌-GLP-1的GLP-1生产能力，发现该菌株通过ELISA在上清液中可产生97.97 ±9.295 pg/mL GLP-1。
(图1b) 丁酸梭菌和丁酸梭菌-GLP-1的生长曲线。与野生菌株丁酸梭菌相比，未观察到丁酸梭菌和丁酸梭菌-GLP-1之间的生长特性的显著差异。
(图1c) 丁酸梭菌和丁酸梭菌-GLP-1的耐酸能力。
(图1d) 丁酸梭菌和丁酸梭菌-GLP-1的胆酸盐耐受性。 发现丁酸梭菌-GLP-I和丁酸梭菌都对酸和胆汁盐具有良好的耐受性。其确保它们在宿主胃和肠道中存活
2.丁酸梭菌-GLP-1改善PD小鼠的运动功能障碍
(图2a）整个实验的示意性工作流程，建立 MPTP 诱导的 PD 小鼠模型。
（图2b）杆测试，结果显示，丁酸梭菌 GLP-1或利拉鲁肽均能显著改善 M 组运动能力的下降。同时，丁酸梭菌GLP-1和利拉鲁肽之间无统计学差异。结果发现单独的丁酸梭菌显示出改善的行为(但这种差异很小
（图2c）挂线测试，酸假丝酵母 -GLP-1显示与杆试验相同的趋势 ，表明丁酸梭菌 GLP-1可以改善 PD 小鼠的肌肉力量和平衡。
（图2d）旷场试验中的总移动距离，
（图2e）在旷场试验中中心区域移动的距离，丁酸梭菌GLP-1组小鼠总行进距离和在中心区域行进的距离（都大幅增加（图 2d，e）
（图2f）旷场试验的代表性迹线。M组小鼠的探索能力低于C组，丁酸梭菌GLP-1组小鼠的探索能力也低于C组
这些结果表明，丁酸梭菌 GLP-1可以改善 PD 小鼠的运动功能障碍。
3.丁酸梭菌-GLP-1减轻PD小鼠的神经病理学改变
(图3a) TH的代表性免疫组化分析。在M组中，SN和纹状体（CS）中存在严重的TH阳性细胞衰退，通过使用利拉鲁肽、C. butyricum和C. butyricum-GLP-1治疗，这种情况得到改善。
(图3b) α-syn的代表性免疫组化分析。在M组中，PD的病理标志物α-syn增加，而C. butyricum-GLP-1大大减少了α-syn。
(图3c) SN中DAT（多巴胺转运体）、TH、α-syn和β-actin表达的蛋白印迹分析。
图3(d-f) 对α-syn（d）、TH（e）和DAT（f）的蛋白印迹进行定量分析，DAT，一个对PD重要的蛋白，显示出与TH相同的趋势。因此，这些结果显示，C. butyricum-GLP-1可能通过下调黑质α-syn的水平，提高TH和DAT的水平来改善PD小鼠的神经病理。
(图4a) ELISA分析SN中GLP-1的浓度，结果显示，与C组相比，MPTP显著降低GLP-I浓度，而利拉鲁肽和丁酸梭菌-GLP-1处理增加GLP-I浓度。
(图4b) Western blotting分析SN中GLP-1R和β-actin的表达。
(图4c) GLP-1R的Western印迹的定量分析。
(图4d) 免疫组化对GLP-1R含量的定量分析。
(图4e) GLP-1R的免疫组化分析
结果显示MPTP处理显著抑制了GLP-1 R的表达，但MPTP处理组的GLP-1 R表达水平明显低于对照组，而MPTP处理组的GLP-1 R表达水平明显低于对照组。利拉鲁肽和丁酸梭菌-GLP-1处理极大地上调了GLP-1 R的表达，这些结果表明丁酸梭菌-GLP-1增加了PD小鼠中GLP-1和GLP-1 R的浓度。
6. 丁酸梭菌-GLP-I减轻PD小鼠中的OS（氧化应激）
相关研究已显示线粒体损伤可导致OS。
（图6a-c）血清中GSH-Px、SOD和MDA的活性。
（图6d-f）SN中GSH-Px、SOD和MDA的活性。
结果显示与C组相比，MPTP可显著降低SOD活性。并显著升高MDA水平而利拉鲁肽、丁酸梭菌和丁酸梭菌-GLP-1增加SOD水平和GSH-Px，同时氧化产物MDA在CBG组中显著降低，与SN中的趋势相似。
7.丁酸梭菌-GLP-I改善PD小鼠的肠道微生物组
（a-b）Chao 1指数，Faith_pd指数，结果显示，与C组相比，M组的α多样性包括Chao 1指数和Faith_pd指数大大降低。尽管如此，丁酸梭菌-GLP-I增加α-多样性。
（c）OTU的维恩图。每组共发现515个共同OTU，C、M、L、CB和CBG组分别发现1686、658、1184、1044和1420个独特的OTU。
（d）β多样性指数的PCoA。分析结果表明，M组样本点远离C组，而CBG组采样点与C组样本点较近，M组采样点较M组较多，表明MPTP与C组相比β多样性变化极大， 丁酸衣原体-GLP-1处理的β多样性与M组不同。
（e）门一级的微生物群组成。在门水平上，厚壁菌、拟杆菌、放线菌和疣状微生物是这五组中最常见的四个优势门。
（f）放线菌的相对丰度。检查了PD相关益生菌和病原体的相对丰度。MPTP相对于C组大大增加了M组放线菌的相对丰度，丁酸梭菌-GLP-1处理降低了这种变化，但没有统计学差异。
（g）属水平的微生物群组成：普雷沃氏菌（h）、阿克曼氏菌（i）和双歧杆菌（j）的相对丰度，在属水平（图7g-j），MPTP降低了普雷沃氏菌的丰度，并显着增加了双歧杆菌相对于C组的丰度。而丁酸梭菌-GLP-1处理恢复了双歧杆菌丰度的降低。
因此，这些结果证明丁酸衣原体-GLP-1可以恢复PD小鼠的肠道微生物组。
8.丁酸梭菌-GLP-1恢复PD小鼠的肠道完整性并上调GPR 41/43水平
最近的研究发现，C. butyricum通过GPR41/43发挥神经保护作用，这些是丁酸的受体。
（a-b）GPR43 和 GPR41 IHC 分析，结果显示，与C组相比，MPTP显著减少GPR 41和GPR 43阳性细胞，而利拉鲁肽、C.丁酸菌C.丁酸-GLP-1增加GPR 41/43阳性细胞
（c-e）结肠中GPR 41、GPR 43表达的蛋白质印迹及其定量分析。蛋白质印迹进一步支持了形态学发现
（f-h）结肠中ZO-1、闭合蛋白和β-肌动蛋白表达的蛋白质印迹及其定量分析。结果表明，与C组相比，MPTP对ZO-1和闭合蛋白的表达有较大抑制作用，但利拉鲁肽、丁酸梭菌和丁酸梭菌-GLP-1恢复了这些变化，特别是在CBG组中
因此，这些结果显示，C. butyricum-GLP-1恢复了PD小鼠的GPR41/43和肠道紧密连接蛋白的水平。
小结
总的来说，结果表明，C. butyricum-GLP-1可以分泌GLP-1，穿过血脑屏障进入大脑，并作用于GLP-1R，激活有丝分裂途径，从而发挥其对PD的神经保护作用，并且可以通过纠正胃肠道内的菌群失调来增强肠道粘膜屏障，促进PD的改善。这是第一项联合丁酸梭菌和GLP-1的益生菌特性以评估对PD的影响的研究。需要注意的是，在这项工作中，只调查了C. butyricum-GLP-1能够通过增强有丝分裂的作用来治疗帕金森病，但有丝分裂诱导的确切分子机制和肠道微生物群与帕金森病之间的具体关系还需要进一步研究。此外，两侧的TH免疫组化染色可能更准确，应检测丁酸的含量。
