免疫检查点阻断（ICB）疗法已成为癌症治疗最有前景的策略之一。靶向PD-1的帕博利珠单抗已被批准为具有微卫星不稳定型（MSI）结直肠癌（CRC）患者的一线治疗。然而，绝大部分微卫星稳定型（MSS）CRC患者对抗PD-1治疗不敏感，不适合进行ICB治疗。因此，寻找能够增强MSS
CRC抗PD-1治疗效果的新策略具有重要意义。多项研究表明，肠道微生物显著影响宿主对ICB治疗的响应性。然而，驱动ICB响应的肠道微生物仍然知之甚少。具核梭杆菌（Fn）是一种革兰氏阴性厌氧菌，被认为是CRC的致病菌，其丰度与肿瘤进展呈正相关。一项涉及1041名CRC患者的临床研究表明，Fn的丰度与MSS
CRC中的肿瘤浸润淋巴细胞富集呈正相关，表明Fn可能对MSS
CRC肿瘤免疫微环境产生影响。然而，Fn在MSS
CRC肿瘤治疗中的作用尚不清楚。
2024年9月19日，香港中文大学于君教授团队在Cancer
Cell（IF2023=48.8）期刊上发表了题为“Fusobacterium
nucleatum facilitates anti-PD-1 therapy in microsatellite stable colorectal
cancer”的研究论文。该研究揭示Fn在调节MSS型CRC患者抗PD-1单抗免疫治疗反应中的潜在功能及其分子机制，并进一步表明提高肿瘤内Fn丰度及其代谢产物丁酸，有望成为改善anti-PD-1治疗微卫星稳定型结直肠癌效果的潜在策略。
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该研究首先分析接受抗PD-1单抗治疗的MSS型CRC患者粪便和肿瘤组织，探讨Fn对患者抗PD-1治疗的影响。随后，利用多种动物模型、粪菌移植或直接补充Fn及其代谢物丁酸，评估这些处理对肿瘤生长、免疫细胞浸润和PD-1表达的影响。其次，作者通过代谢组学分析鉴定Fn衍生的代谢物，并在体内外验证这些代谢物对肿瘤的影响。最后，作者还利用RNA测序、ChIP-qPCR和CRISPR-Cas9等技术，揭示Fn通过HDAC3/8-TBX21轴调控CD8+
T细胞中PD-1表达的分子机制（Fig 1）。![]()
Fig
1. Fn通过HDAC3/8-TBX21轴调控CD8+
T细胞中PD-1表达的分子机制
通过检测治疗前MSS型CRC患者的粪便和肿瘤样本，发现在接受抗PD-1治疗后，患者的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）与Fn的丰度呈正相关。此外，含高丰度Fn的CRC肝转移患者对抗PD-1治疗的应答率更高，表明Fn可改善MSS型CRC患者抗PD-1治疗的效果。同样，该结果也在原位CT26同种异体移植瘤无菌小鼠模型上得到有效证实（Fig 2）。![]()
Fig 2. 肠道Fn丰度与MSS
CRC患者抗PD-1治疗疗效呈正相关
Fn通过抑制PD-1表达促进MSS型CRC模型小鼠的抗PD-1应答
通过建立原位HT29异种移植CD34+人源化免疫小鼠模型来模拟人类免疫应答。结果发现，Fn加速肿瘤的生长，而Fn和抗PD-1单抗联用，肿瘤生长明显受到抑制。此外，还发现Fn抑制PD-1的表达，并与抗PD-1单抗联用可重新激活细胞毒性CD8+ TILs，以介导MSS型CRC人源化小鼠的肿瘤细胞杀伤（Fig 3）。
Fig 3. Fn增强MSS型CRC模型小鼠抗PD-1治疗效果
Fn单独定植可促进模型小鼠全身CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫
通过对无菌小鼠皮下HT29异种移植来构建的CD34+T人源化免疫小鼠模型，给予Fn、U159A及PBS干预，结果发现Fn可明显抑制肿瘤的生长，且Fn单独定植可通过诱导CD8+TILs的系统活化来增强抗肿瘤免疫（Fig 4）。Fig 4. Fn通过激活MSS型CRC模型小鼠中CD8+TILs来增强抗PD-1的疗效
Fn通过其代谢物丁酸抑制PD-1表达并重新激活CD8+T细胞
由于已经证实Fn分泌物在MSS型CRC中增加了抗PD-1的疗效，作者接下来根据分子量大小对Fn条件培养基进行分离。结果显示＜3 kDa部分对CD8+T细胞中PD-1的抑制作用最强。通过代谢物富集分析发现丁酸是Fn最富集的代谢物，且其可以剂量依赖的方式抑制CD8+T细胞中PD-1表达，同时诱导细胞毒性标志物（如TNF-α、GZMB和IFN-γ）的上调（Fig 5）。Fig 5. Fn通过其小分子代谢物降低CD8+T细胞中PD-1的表达Fn通过其代谢物丁酸增强anti-PD-1治疗的反应
为了探究丁酸对anti-PD-1治疗的作用，作者通过构建缺乏合成丁酸能力的Fn突变株。结果发现Fn突变株的分泌物在抑制CD8+T细胞中PD-1表达的作用明显较差，且未能诱导CD8+T细胞中相关细胞毒性标志物的表达。同样，在CT26荷瘤小鼠的CD8+TILs细胞也得到验证。以上结果说明，Fn增强CD8+T细胞的抗肿瘤作用依赖于丁酸的产生（Fig 6）。![]()
Fig 6. Fn通过其代谢物丁酸增强了对anti-PD-1治疗的反应
Fn通过其代谢物丁酸增强anti-PD-1单抗的肿瘤杀伤作用
进一步，作者将来自患者外周血单个核细胞衍生的CD8+T细胞与原代CRC类器官进行共培养，发现与Fn突变株分泌物相比，Fn 条件培养基与抗PD-1单抗或丁酸与抗PD-1单抗联合处理，可显著增加CRC类器官中的细胞凋亡。此外，还明显抑制CD8+T细胞中PD-1表达，促进细胞毒性标志物的表达（Fig 7）。![]()
Fig 7. Fn通过其代谢物丁酸增强抗PD-1单抗的肿瘤杀伤作用
Fn代谢物丁酸以CD8+T细胞依赖的方式促进MSS型CRC的anti-PD-1疗效
同样，作者继续在CT26荷瘤小鼠体内验证丁酸促进anti-PD-1疗效的功能，发现仅使用丁酸可抑制肿瘤的生长，加用抗PD-1单抗后对肿瘤的抑制作用更为明显。然而，经抗CD8抗体处理后丁酸联合抗PD-1单抗的抑瘤作用消失（Fig 8）。![]()
Fig 8. Fn代谢物丁酸以CD8+T细胞依赖的方式促进MSS型CRC的抗PD-1疗效
Fn及其代谢物丁酸通过抑制HDAC3/8上调Tbx21增强anti-PD-1疗效
为了探究Fn及其代谢物丁酸增强anti-PD-1治疗的作用机制，作者通过对CD8+T细胞进行RNA-seq分析，发现Fn和丁酸可诱导多个效应T细胞相关基因的表达，其中活化T细胞表达的关键转录因子Tbx21被特异性上调。敲除Tbx21基因后，CD8+T细胞中PD-1表达增加。此外，通过FITC标记发现丁酸在CD8+T细胞核中积累，还证实Fn及其代谢物丁酸可通过抑制HDAC3/8来富集CD8+ TILs中Tbx21启动子上的H3K27ac，从而提高Tbx21的表达，并逆转MSS型CRC中CD8+ TILs的耗竭（Fig 9）。![]()
Fig 9. Fn代谢物丁酸通过表观遗传机制调控CD8+T细胞并上调TBX21表达
该研究通过一系列体内外实验证实Fn通过丁酸-HDAC3/8-TBX21轴抑制CD8+TILs中PD-1过表达，导致抗肿瘤免疫重新激活，在增强MSS型CRC抗PD-1治疗中起着重要作用。这些结果表明Fn的丰度可能是预测MSS型CRC抗PD-1治疗疗效的潜在生物标志物，并提示增加肠道中丁酸的含量可能是改善MSS型CRC患者对抗PD-1免疫治疗临床反应的一种潜在策略。（1）考虑到人类免疫系统的复杂性，CD34+人源化免疫缺陷小鼠模型可能仍无法全面复制所有免疫细胞谱系的特性。因此，研究结果可能存在一定的局限性，值得在未来的研究中进一步探讨。（2）研究中使用的Fn突变株为我们提供了重要的初步数据。然而，野生型Fn在体内的实际作用可能更为复杂。这一点提醒我们在未来的实验中需要更加细致地验证和探讨，以获得更全面的理解。（3）肠道内存在的多种能产生丁酸的细菌是否会对Fn增强MSS型CRC患者anti-PD-1疗效产生干扰，是一个值得进一步深入研究，以便更好地理解各菌株之间的相互作用。
https://doi.org/10.1016/j.ccell.2024.08.019
编辑：彭婉 排版：邹婷婷 审核：徐唐昌
