CAR-T细胞疗法已发展为一种潜在的治愈性疗法，但持久反应率仍然有限，大多数患者在治疗的第一年内复发。越来越多的证据表明，T细胞耗竭导致了CAR-T细胞在临床上的失败。
T细胞耗竭是一种表观遗传调节的功能障碍状态，由CD8+ T细胞的T细胞受体（TCR）或CAR-T细胞中的CAR的慢性刺激引起。耗竭的特征是表型、功能、转录和表观遗传变化。表型变化包括细胞上多个抑制性受体的上调，如程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域蛋白3（TIM-3）。功能变化包括增殖能力下降和产生效应细胞因子（如白介素（IL）-2和肿瘤坏死因子（TNF）-α）的能力下降，随后在后期失去产生干扰素（IFN）-γ的能力。此外，耗竭的T细胞经历了代谢变化，如糖酵解受损。转录和表观遗传变化包括多个转录因子活性的变化，包括TCF-7、TOX、T-BET、以及AP-1和RUNX家族成员等。为了控制对慢性刺激的表观遗传反应，一些研究人员选择使用基因工程工具来过表达或敲除单个分子。虽然增强了对CAR-T细胞耗竭的理解，但迄今为止尚未完全理解分子途径和潜在的治疗干预靶点。
CAR-T细胞耗竭的发生可能因CAR结构和疾病类型而异。例如，独立研究表明，与41BB共刺激的CAR-T细胞相比，CD28共刺激的CAR-T细胞更容易出现耗竭状态。此外，强直性信号转导发生率较高的CAR构建体也与CAR-T细胞耗竭的发展呈正相关。由于免疫抑制性肿瘤微环境的挑战，用于实体瘤治疗的CAR-T细胞有更高的耗竭风险。
作者团队用三种独立的方法研究了CAR-T细胞耗竭的调节，包括：使用体外耗竭模型的全基因组CRISPR敲除筛选、基线和耗竭CAR-T细胞的RNA和ATAC测序，以及ZUMA-1临床试验中来自反应者和无反应者的输注前CAR-T细胞产物的RNA和ATAC测序。这些方法中的每一种都将白细胞介素（IL）-4确定为CAR-T细胞功能障碍的调节因子。除此之外还证明了了IL-4处理的CD8 + CAR-T细胞会出现独立于CD4 + CAR-T细胞存在的耗竭迹象。在对IL-4通路进行编辑或CAR-T细胞与IL-4单克隆抗体组合后，观察到可以提高套细胞淋巴瘤异种移植小鼠模型中的抗肿瘤功效并减少CAR-T细胞耗竭。作者团队最终确定了IL-4在诱导CART耗竭中的作用。
图1内容概述了研究人员建立的体外模型，该模型通过长期刺激健康捐赠者T细胞产生的CART19细胞来诱导耗竭。通过每天添加新鲜的CD19+靶细胞JeKo-1来慢性刺激CART19-28ζ细胞，导致这些细胞逐渐失去功能，表现为体外抗原特异性扩增减少、多个抑制性受体共表达增加以及效应细胞因子如IL-2和TNF-α产生减少。通过mantle cell lymphoma异种移植小鼠模型的实验，研究人员发现与基线（第8天）相比，经过长期刺激（第22天）的CART19-28ζ细胞治疗的小鼠显示出显著降低的抗肿瘤活性和整体生存率，CART细胞扩增减少，外周血液中CART细胞上多个抑制性受体表达上调，以及效应细胞因子IL-2和IFN-γ水平显著降低，而抑制性细胞因子IL-10水平升高，这些结果与体外数据一致，证实了CART细胞表现出耗竭的表型。该模型也被证明适用于不同的肿瘤模型和CAR构建，为研究CART细胞耗竭提供了一个代表性的体外模型。
图2中的内容描述了通过全基因组CRISPR敲除筛选来识别与CAR-T细胞耗竭相关的IL-4信号通路的过程。研究人员使用健康捐赠者的CART19-28ζ细胞进行了这项研究，他们在第2天以0.3的感染复数（MOI）将1×10^8的CART细胞与GeCKO v2库A共转导，并通过从第3天至第8天用普鲁霉素处理来筛选成功转导的细胞。到了慢性刺激试验的第22天，通过Gini指数的增加和主成分分析（PCA）观察到导向RNA（gRNAs）的正向选择。此外，通过基因集富集分析发现，与CART细胞功能障碍相关的基因在筛选中被正向或负向选择，其中包括与干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）和IL-4信号通路相关的几个细胞因子信号通路。独立的病因网络分析显示IL-4受体（IL4R）是一个主要的调控因子。特别地，针对IL-4的三个gRNA中有两个在慢性刺激（第22天）样本中的表达增强，与基线（第8天）样本相比，这表明IL-4信号通路参与了CART细胞的耗竭过程。这些数据共同表明全基因组CRISPR敲除筛选有效地识别了与CART细胞功能障碍相关的正向和负向选择基因。
图3中的内容展示了通过转录组和染色质可及性分析揭示IL-4在CAR-T细胞耗竭发展中的作用，这一作用与其在Th2极化中的经典作用无关。研究人员对基线（第8天）和慢性刺激（第15天）的CART19-28ζ细胞进行了RNA测序和ATAC测序，结果发现了与耗竭表型相关的基因表达差异，例如EOMES、IL10RA和HAVCR2（TIM-3）在慢性刺激的CART19-28ζ细胞中上调，而与耗竭发展负相关的AP-1家族成员如FOS和FOSL2则下调。通路分析显示，在耗竭发展过程中，与代谢相关的通路（如糖酵解和糖异生）被强烈下调，而细胞因子信号通路的重要性被突出显示。ATAC测序显示，在慢性刺激样本中与耗竭相关的基因位点（如PDCD1和ENTPD1）的染色质可及性增强，以及AP-1和RUNX家族成员的基序可及性增强。通过QIAGEN IPA分析，确定了受影响的通路和上游调控因子，其中包括T细胞耗竭通路以及预测的上游调控因子IL-2、IL-15、TCF-7、ITK和IL-4。尽管IL-4通常与CD4+ T细胞的Th2极化相关，但其在CAR-T细胞耗竭发展中的作用尚未被充分研究。此外，图片还展示了不同时间点CART19-28ζ细胞中IL-4的产生情况，以及CD4+和CD8+ T细胞的比例变化，进一步证实了IL-4在CAR-T细胞耗竭中的调节作用。
为了继续探究IL-4在CAR-T细胞耗竭中的作用及其是否因T辅助细胞极化或耗竭发展而成为上游调节因子。作者团队通过体外模型，发现慢性刺激后CART19-28ζ细胞的CD4+群体显著减少，Th2细胞群体减少而Th1细胞群体增加，且在慢性刺激的CART19-28ζ细胞治疗的小鼠中，Th2细胞因子IL-5和IL-13水平降低。而且在慢性刺激后CD8+ CART19-28ζ细胞中IL-4的产生增加，CD4+ CART19-28ζ细胞中IL-4的产生未增加。这些结果表明，IL-4作为耗竭的上游调节因子主要是由于其对CD8+ CAR-T细胞的影响，而非T辅助细胞群体的极化变化，揭示了IL-4在CAR-T细胞耗竭中的重要作用及其与CD8+ CAR-T细胞耗竭的特定关联。
接下来为了进一步确定这个发现在接受 CART19-28ζ 细胞治疗的患者中的意义，作者团队进行了ZUMA-1临床试验中来自反应者和无反应者的输注前CAR-T细胞产物的RNA和ATAC测序。
图4中的内容展示了在对接受CART19-28ζ细胞治疗的患者进行的ZUMA-1临床试验中，非响应者与响应者预输注axi-cel产品之间的基因表达和染色质可及性模式的差异。研究发现，非响应者的样本中IL-4和CCR3基因表达上调，而通过QIAGEN IPA分析发现IL-4是上游调节因子之一。此外，与响应者相比，非响应者的样本在IL-4基因位点显示出增强的染色质可及性，这与体外模型中慢性刺激后CART细胞的表观遗传学变化相似，表明IL-4的调控与CART细胞耗竭的发展一致。这些数据表明，基线CART细胞产品的表观遗传学变化对CART细胞耗竭和临床失败有贡献，特别是在非响应者中IL-4的调控与体外CART细胞耗竭模型中观察到的变化相一致。
图5中的内容展示了IL-4如何独立于CD4+ CAR-T细胞的存在，诱导CAR-T细胞耗竭。通过在体外模型中对CART19-28ζ细胞进行处理，研究人员发现，与仅用稀释剂处理的细胞相比，用20 ng/mL的人重组IL-4 (hrIL-4)处理的CART19-28ζ细胞表现出功能和表型上的耗竭迹象，包括降低的细胞毒性、增殖能力下降、效应细胞因子如IL-2和IFN-γ的产生减少，以及共表达抑制性受体的细胞百分比增加。这些变化与hrIL-4对JeKo-1靶细胞的直接影响无关，因为单独用hrIL-4处理JeKo-1细胞并未影响其生长或存活，也与CAR+ T细胞百分比的变化无关，因为hrIL-4处理的CART细胞表面CAR的表达未发生变化。此外，研究还发现，hrIL-4诱导的CART细胞耗竭不依赖于CART细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，而是hrIL-4对CART细胞的直接影响。这些结果表明，IL-4补充可以驱动不同CAR构建和肿瘤模型中的CART细胞耗竭，强调了IL-4在CAR-T细胞耗竭中的重要作用。
图6中的内容展示了通过中和IL-4来增强CART19-28ζ细胞的持久性和效能的研究成果。研究人员首先利用CRISPR Cas9技术敲除了IL-4基因，创建了IL-4敲低的CART细胞，这些细胞在基线水平显示出增强的细胞毒性，并且在慢性刺激后表现出减少的耗竭迹象，包括增加的CART细胞扩增、效应细胞因子如IL-2和IFN-γ的增加产生，以及多个抑制性受体共表达的减少。使用IL-4单克隆抗体（mAb）在体外实验中完全中和了IL-4，并增加了CART细胞的细胞毒性。在体内实验中，与IgG对照抗体相比，IL-4 mAb与CART19-28ζ细胞的联合使用显著提高了抗肿瘤活性，延长了小鼠的总生存期，并改善了CART细胞的扩增，减少了表达多个抑制性受体的CART细胞百分比，以及降低了抑制性细胞因子IL-10的分泌。这些数据表明，通过中和IL-4可以减少CART细胞的耗竭，并提高其抗肿瘤活性。
综上，作者团队通过一系列体外和体内实验，揭示了IL-4在CAR-T细胞耗竭中的关键作用，并展示了通过基因编辑敲低IL-4或使用IL-4单克隆抗体中和IL-4来减少CAR-T细胞耗竭和增强其抗肿瘤活性的潜力。通过研究发现，IL-4诱导的CAR-T细胞耗竭与CD4+ T细胞的比例变化无关，而是直接影响CD8+ CAR-T细胞。在临床相关的ZUMA-1试验中，非响应者的CAR-T细胞产品中IL-4表达上调，表现为与耗竭相关。通过CRISPR技术和单克隆抗体的应用，研究人员证明了阻断IL-4信号通路可以改善CAR-T细胞的功能和持久性，这为提高CAR-T细胞疗法的疗效提供了新的方向。
