近年来，免疫疗法作为一种有前景的策略出现，利用免疫系统的潜力来专门针对并消灭癌细胞。两种显著的免疫疗法，嵌合抗原受体（CAR）T细胞和单克隆抗体（mAbs），已在临床环境中对某些恶性肿瘤显示出治疗益处。目前，正在进行广泛的研究，以扩大这两种免疫疗法的应用范围，特别是针对实体瘤。为了使这两种免疫治疗方法有效，肿瘤细胞必须表达独特的膜分子，这些膜分子可以靶向识别和破坏。尽管已有几种肿瘤相关抗原（TAAs），如人类表皮生长因子受体2（HER2）、表皮生长因子受体（EGFR）、间皮素（MSLN）和前列腺特异性膜抗原（PSMA），被报道为可行的靶标，但许多肿瘤不表达这些TAAs，因此无法从这些实验性免疫治疗干预中受益。即使对于那些表达这些TAAs的肿瘤，也有一个问题，即某些正常组织也表达这些分子，这可能导致非肿瘤靶向毒性。
之前的早期研究表明，一个与膜蛋白细菌视紫质C螺旋相对应的明确短肽可以pH依赖性地插入脂双层膜。设计的pH低插入肽（pHLIP），它基于pH存在三种不同的状态：状态I，在没有脂膜的中性pH条件下，pHLIP作为无结构单体存在于溶液中；状态II，在中性pH条件下，pHLIP结合到脂双层表面并主要保持其无结构单体构象；状态III，在酸性pH条件下，pHLIP穿过脂双层并采用单体螺旋结构。pHLIP这种独特的pH依赖性插入质膜的特性促进了使用它来针对酸性实体瘤微环境进行诊断或治疗的研究。例如，据报道，将荧光染料或纳米金颗粒与pHLIP结合可以敏感地成像许多实体瘤。结合治疗载荷，如毒素分子、小分子药物、DNA或RNA遗传物质或含有治疗化合物的纳米颗粒，允许这些治疗载荷在酸性实体瘤微环境中表现出抗肿瘤效果。
在当前研究中，我们调查了使用pHLIP将替代抗原，即c-Myc标签，移植到肿瘤细胞上，以便通过CAR-T细胞或识别这种替代抗原的单克隆抗体来普遍治疗实体瘤的可能性。这项调查是为了解决该领域中的一个主要挑战——许多实体瘤中缺乏可靶向的TAAs。我们的数据表明pHLIP确实可以有效地以pH依赖的方式将c-Myc标签插入细胞表面。在体内表征显示，当结合pHLIP-Myc标签输注与CAR-T细胞或针对c-Myc标签的单克隆抗体时，显示出显著的抗肿瘤活性。这些发现证明了使用pHLIP移植替代抗原以克服癌症免疫疗法的主要障碍之一——缺乏普遍且特异性的肿瘤相关抗原来治疗实体瘤的可能性。此外，pHLIP在酸性肿瘤微环境中将替代抗原移植到恶性和基质细胞的能力，可能使CAR-T或mAb治疗比仅针对肿瘤细胞更有效。
在本研究中，作者团队研究了使用pHLIP将替代抗原c-Myc标签移植到肿瘤细胞上的可能性，以通过识别该替代抗原的CAR-T细胞或单克隆抗体普遍治疗实体瘤。这项研究的启动是为了解决该领域的首要挑战之一——许多实体瘤中缺乏可靶向的TAA。数据表明，pHLIP确实可以以pH依赖性方式有效地将c-Myc标签插入细胞表面。体内表征显示，当pHLIP-Myc标签输注与CAR-T细胞或靶向c-Myc标签的单克隆抗体联合输注时，具有显著的抗肿瘤活性。这些发现证明了使用pHLIP移植替代抗原以克服癌症免疫治疗的主要障碍之一的可能性，即缺乏用于治疗实体瘤的通用和特异性肿瘤相关抗原。此外，pHLIP将替代抗原移植到酸性肿瘤微环境中的恶性细胞和基质细胞的能力可能使CAR-T或mAb治疗比仅靶向肿瘤细胞更有效。
图1展示了一种新型的pHLIP肽（Myc-pHLIP），它能够将c-Myc标签作为替代抗原插入到肿瘤细胞表面。A部分提供了Myc-pHLIP的结构示意图，显示了pHLIP的N端带有c-Myc标签和用于检测的FITC荧光素。B部分通过流式细胞仪分析了Myc-pHLIP在不同pH条件下与肿瘤细胞的结合效率，显示在酸性条件下（pH 6.2和6.6），Myc-pHLIP能显著结合到肿瘤细胞上，而在中性pH条件下（pH 7.4）结合效率低。C部分通过荧光显微镜观察了Myc-pHLIP在不同pH条件下与肿瘤细胞的结合情况，结果与流式细胞仪分析一致。这些结果表明Myc-pHLIP能够在酸性pH条件下有效地将c-Myc标签插入肿瘤细胞膜，从而可能作为实体瘤免疫疗法的靶点。此外，实验还发现L-15培养基质对于pH依赖的pHLIP细胞膜插入是必需的，而其他如RPMI1640培养基质则无法准确维持所需的pH，这会影响实验的准确性。
图2展示了Myc-CAR T细胞的设计、转导效率和对肿瘤细胞的杀伤能力。A部分展示了Myc-CAR的结构，包括LTR、Myc标签的单链抗体片段（scFv）、跨膜域（TM）、CD28、CD3ζ链、T2A自切割肽和GFP。B部分通过流式细胞仪分析显示，Myc-CAR在人类和小鼠T细胞中的转导效率超过50%。C部分提供了用于建立A549-Myc和Panc02-H7-Myc细胞系的Myc-GFP慢病毒载体的结构图。D和E部分评估了A549细胞的转导效率，结果表明转导效率在人类A549细胞和小鼠Panc02-H7细胞中均超过80%。F至H部分通过流式细胞仪分析显示，Myc-CAR-T细胞能选择性地高效消灭表达Myc标签的肿瘤细胞。这些结果证明了Myc-CAR-T细胞能够特异性地识别并有效杀伤表达Myc标签的肿瘤细胞。
图3展示了Myc-pHLIP肽在不同pH条件下对人类肿瘤细胞的杀伤效果。A部分通过流式细胞仪分析了Myc-pHLIP在不同浓度和pH条件下与肿瘤细胞的结合情况，显示在酸性条件下（pH 6.2和6.6），Myc-pHLIP能显著结合到肿瘤细胞上，而在中性pH（pH 7.4）条件下结合效率低。B部分图表显示了Myc-CAR T细胞在不同pH条件下对A549肿瘤细胞的杀伤效果，结果表明在酸性条件下Myc-CAR T细胞能有效杀伤肿瘤细胞。C部分的图表进一步分析了Myc-pHLIP插入与Myc-CAR T细胞杀伤效果之间的关系，显示在pH 6.2条件下两者之间存在强烈的正相关性，而在pH 7.4条件下无明显相关性。这些结果表明Myc-pHLIP能在酸性条件下有效地将替代抗原插入肿瘤细胞表面，从而被Myc-CAR T细胞识别并杀伤，具有高特异性。
图4展示了Myc-pHLIP肽在酸性pH条件下对小鼠肿瘤细胞的杀伤效果。A部分通过流式细胞仪分析了Panc02-H7细胞在不同Myc-pHLIP浓度下的杀伤情况，显示在酸性pH条件下，Myc-pHLIP能显著增加小鼠Myc-CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤。B部分图表显示了在pH 6.2条件下，不同Myc-pHLIP浓度下Panc02-H7细胞的杀伤数据，结果表明在Myc-pHLIP存在时，杀伤效果显著增加。C部分展示了在酸性pH条件下，Myc-pHLIP对4T1细胞的结合强度，证明了其能结合到这些细胞上。D部分通过流式细胞仪分析了4T1细胞在不同Myc-pHLIP浓度下的杀伤情况，结果表明在Myc-pHLIP存在时，杀伤效果显著增加。这些结果强调了Myc-pHLIP在酸性pH条件下使人类和小鼠来源的肿瘤细胞对CAR T细胞杀伤敏感的能力，展示了这种肽在癌症治疗中的普遍适用性。
图5展示了Myc-CAR T细胞在有无Myc-pHLIP肽共给药的情况下对A549肿瘤异种移植物的治疗评估。A部分描述了实验方案，包括在SCID小鼠中皮下植入A549肿瘤细胞，当肿瘤达到约5毫米直径时，随机分为两组，一组接受Myc-pHLIP尾静脉注射，另一组接受对照肽。随后两组小鼠均接受Myc-CAR T细胞的过继转移。B部分显示了治疗后的肿瘤生长曲线，C部分展示了实验结束时（第18天）通过称重切除的肿瘤体积。结果表明，即使只给予单剂量的Myc-pHLIP，也能显著增强肿瘤对Myc-CAR T细胞杀伤效果的敏感性，与对照组相比显示出显著的治疗效果。治疗组的肿瘤生长在治疗后几乎一周内停止，尽管肿瘤最终恢复生长（可能是由于注入的Myc-pHLIP逐渐消散），但与对照组相比，生长速率显著减慢。这些数据强烈表明Myc-pHLIP肽的加入能选择性地增强肿瘤细胞对Myc-CAR T细胞体内杀伤的敏感性。
图6展示了Myc-pHLIP肽在不同pH条件下对A549和Panc02-H7肿瘤细胞的杀伤效果，以及Myc-pHLIP与9E10单克隆抗体（mAb）联合使用对Panc02-H7肿瘤模型的治疗效果。A部分通过流式细胞仪分析了Myc-pHLIP在不同浓度和pH条件下与肿瘤细胞的结合情况，显示在酸性pH条件下Myc-pHLIP能显著结合到肿瘤细胞上。B部分图表显示了在酸性pH条件下，Myc-pHLIP与9E10 mAb联合使用时，对A549肿瘤细胞的杀伤效果。C部分通过流式细胞仪分析了Myc-pHLIP在不同浓度和pH条件下与Panc02-H7肿瘤细胞的结合情况，D部分图表显示了在酸性pH条件下，Myc-pHLIP与9E10 mAb联合使用时对Panc02-H7肿瘤细胞的杀伤效果。E部分展示了在Myc-pHLIP和9E10 mAb联合治疗后Panc02-H7肿瘤的生长曲线，F部分展示了在Myc-pHLIP和9E10 mAb联合治疗后Panc02-H7肿瘤的最终体积，G部分展示了单独使用9E10 mAb或PBS（对照）处理后Panc02-H7-Myc肿瘤的生长曲线，H部分图表显示了在9E10 mAb或PBS处理后Panc02-H7-Myc肿瘤的最终体积。结果表明，Myc-pHLIP与9E10 mAb联合使用在酸性pH条件下能有效增加肿瘤细胞对杀伤的敏感性，并且在Panc02-H7肿瘤模型中显示出显著的治疗效果。
作者团队开发了一种新型的免疫疗法，通过将替代抗原c-Myc标签通过pHLIP肽锚定到肿瘤细胞表面，从而实现对实体瘤的普遍治疗。设计了一种名为Myc-pHLIP的新型肽，它能够在酸性条件下将c-Myc标签插入肿瘤细胞膜，使得这些细胞能够被Myc-CAR T细胞或抗Myc标签的单克隆抗体识别并杀伤。实验结果表明，Myc-pHLIP在酸性肿瘤微环境中有效地插入c-Myc标签，并且在体外实验中显著增强了CAR T细胞和单克隆抗体对肿瘤细胞的杀伤能力。此外，研究者还评估了Myc-pHLIP与抗Myc标签单克隆抗体联合使用对Panc02-H7肿瘤模型的治疗效果，发现这种联合疗法能够显著抑制肿瘤生长，显示出Myc-pHLIP在癌症治疗中的潜力，为后续的治疗方案发展开拓了新思路。
