聚集规律间隔回文重复序列(CRISPR) /CRISPR相关蛋白（Cas）系统是细菌和古细菌的适应性免疫系统，通过识别核酸和降解外源核酸发挥作用。Cas9、Cas12a和Cas13a蛋白分别属于II型、V型和VI型CRISPR系统的效应核酸酶。这些蛋白通过识别靶核酸和crRNA之间的互补碱基对，促进crRNA介导的靶核酸裂解。然后，crRNA与目标序列杂交形成双链，而使非目标链（NTS）处于未结合状态。crRNA与靶链（TS）结合激活Cas的顺式裂解活性，随后催化靶核酸的裂解。尽管功能相似，Cas9、Cas12a和Cas13a具有不同的机制特征。例如，Cas13a需要一个protospacer侧翼序列（PFS），类似于protospacer相邻基序（PAM）序列，它包含单个A、U或C碱基。此外，已知Cas9和Cas12a靶向DNA，而Cas13a靶向RNA。除了Cas蛋白固有的顺式切割活性外，Cas12a和Cas13a还具有反式切割活性，使其能够在激活后切割单链非靶标核酸。
反式切割活性的发现表明Cas12a和Cas13a可用于开发潜在的下一代分子诊断技术。CRISPR/Cas系统已广泛应用于荧光、比色、电化学等多种信号检测系统，在构建核酸和非核酸靶点检测的新型生物传感器中得到广泛应用。CRISPR/Cas系统在体内基因编辑中的应用也得到了探索。然而，在细胞内环境下研究CRISPR/Cas系统的催化过程对于理解核酸裂解的机制以及进一步开发基于CRISPR的新型技术是必要的。然而，迄今为止，Cas12a和Cas13a蛋白的体内催化行为很少被研究。
ATPS中的CRISPR/Cas12a催化系统（顺式裂解和反式裂解活性）（图源自Advanced Science ）
细胞区隔化使生物分子的分离成为可能，从而促进了数千种生化反应的同时发生。细胞内区隔化被广泛认为是生命的重要组织原则。越来越多的研究表明，非膜细胞器可以支持生物反应的区室化，类似于膜结合的区室，这可能反映了它们从丰富的益生元化学过渡到最早的生命形式。非膜细胞器包括缺乏脂质边界的亚细胞体，尺寸为0.01-10µm。胞内非膜细胞器包括核仁、应力颗粒、P颗粒等，可执行多种生物功能。此外，这些无膜细胞器表现出液体的特性，具有高度的动态性。这些凝聚体由蛋白质和核酸组成，可以在几分钟或几小时内保持其形状和尺寸。它们还可以在短时间内与周围环境交换物质，并通过促进酶和其他分子的分离来调节各种生物活动，包括RNA代谢、核糖体生物发生等。
支持凝聚体形成的液-液相分离（LLPS）系统被认为是研究非膜细胞器的重要模型系统。各种低聚物和聚合物可以在液相中自发形成含有高浓度核酸和其他分子的LLPS。这些独立的凝聚体可以促进生物反应，而来自其他分子的干扰是由于酶和底物在凝聚体内的选择性定位。Christopher A. Strulson等人通过研究聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（dextran）的水两相体系（ATPS），观察到富葡聚糖相中RNA的浓度比整体溶液高3000倍，核酶的裂解速率提高了70倍。这些酶在LLPS中表现出不同的催化行为。
CRISPR-Cas在大分子聚集的细胞核中起作用。在这种情况下，Cas12a和Cas13a的反式和顺式切割活性仍然知之甚少。研究了CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a系统在ATPS系统中的酶催化作用，ATPS系统是一种简单且广泛使用的模拟细胞内环境的模型，由PEG/葡聚糖形成。该系统已被证明支持简单的生化反应。研究证明，在ATPS系统中，Cas12a的顺式切割活性被提升，而Cas12a的反式切割活性被抑制。总之，研究为细胞内条件下CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a的顺式和反式DNA酶活性提供了一个模型，并可能有助于开发新的基于CRISPR的生物工具。
参考消息：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202407194
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